- Принцип методу біологічної оцінки
- Стандартні зразки і поняття одиниці дії
- Метод біологічної оцінки серцевихглікозидів на жабах
- Техніка випробування і принцип розрахунку
Вміст (Table of Contents)
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я І НАУКИ УКРАЇНИ
ЗАГАЛЬНА фармакопейних статей
Біологічні методи оцінки ОФС.1.2.4.0009.15
активності лікарського
рослинної сировини і
лікарських препаратів, Замість ст. ГФ XII, ч.1,
містять серцеві глікозиди ОФС 42-0065-07
До лікарській рослинній сировині та лікарських рослинних препаратів, для яких проводиться біологічна оцінка активності серцевихглікозидів, відносяться:
- Листя наперстянки пурпурової, крупноцветковой і їх лікарські препарати.
- Лікарські препарати наперстянки шерстистої.
- Трава, лікарські препарати горицвіту.
- Трава, листя, квітки конвалії, лікарські препарати конвалії, складні лікарські форми, що містять настойку конвалії.
- Насіння і лікарські препарати строфанта.
- Трава і насіння желтушника розлогого (сірого), складні лікарські форми, що містять жовтушник сірий і ін.
Принцип методу біологічної оцінки
Біологічна оцінка зазначених вище лікарських засобів заснована на здатності серцевихглікозидів в токсичних дозах викликати систолічну зупинку серця тварин.
Активність лікарських засобів, що містять серцеві глікозиди, оцінюють у порівнянні з активністю стандартних зразків і висловлюють в одиницях дії (ОД).
Випробування проводять на жабах різних видів. Встановлюють найменші дози стандартного зразка і випробуваного лікарського засобу (випробуваного лікарської рослинної сировини / препарату), що викликають систолічну зупинку серця піддослідних тварин. Потім розраховують зміст одиниць дії в 1 г випробуваного лікарського засобу (ІЛС), якщо випробовується лікарську рослинну сировину або сухі концентрати; в одній таблетці - при випробуванні таблеток або в 1 мл, якщо випробовуються рідкі лікарські форми.
Стандартні зразки і поняття одиниці дії
Стандартним зразком (СО) при випробуванні лікарської рослинної сировини і лікарських препаратів конвалії, комплексних лікарських препаратів, що містять настойку конвалії, служать спеціально виготовлені спиртові екстракти конвалії, що містять очищену від супутніх речовин суму серцевихглікозидів конвалії.
СО при випробуванні лікарської рослинної сировини і лікарських препаратів наперстянки пурпурової і крупноцветковой служать спеціально отримані спиртові екстракти наперстянки зазначених видів, що містять очищену від супутніх речовин суму серцевихглікозидів.
Стандартними зразками при випробуванні іншого лікарської рослинної сировини і отриманих з нього лікарських препаратів служать індивідуальні кристалічні глікозиди: при випробуванні лікарських препаратів наперстянки шерстистої - целанид-стандарт; при випробуванні лікарської рослинної сировини і препаратів горицвіту - цимарин-стандарт; при випробуванні лікарської рослинної сировини і лікарських препаратів строфанта - строфантин G-стандарт; лікарської рослинної сировини і лікарських препаратів желтушника сірого - ерізімін-стандарт.
Біологічну активність стандартних зразків встановлюють на жабах-самцях (Rana temporaria) масою 28 - 33 г при підшкірному введенні в жовтні-листопаді (таких жаб умовно називають «стандартними» або «нормальними»).
При випробуванні на жабах розведення стандартних зразків підбирають з таким розрахунком, щоб одна жаб'яча одиниця дії
(1 ЛІД) відповідала дозі стандартного зразка, що викликає в певних умовах досвіду систолическую зупинку серця у більшості стандартних піддослідних жаб.
Під 1 ЛІД конвалії або наперстянки мають на увазі специфічну біологічну активність 0,3 мл стандартного спиртового зразка, розведеного в 4 рази водою. Нерозведені стандартні зразки наперстянки і конвалії містять в 1 мл 13,33 ЛІД.
Під 1 ЛІД цимарин, Целаніду увазі специфічну біологічну активність 0,3 мл стандартного спиртоводного розчину кристалічного глікозиду в наступній концентрації:
цимарин 1: 13333
Целаніду 1: 5000
Під 1 ЛІД строфантину G, ерізіміна увазі специфічну біологічну активність 0,4 мл стандартного спиртоводного розчину кристалічного глікозиду в наступній концентрації:
строфантину G 1: 20000
ерізіміна 1: 25000
Метод біологічної оцінки серцевихглікозидів на жабах
Відбір жаб і умови їх утримання
Для дослідів придатні жаби-самці видів: трав'яна (Rana temporaria) масою 28 - 40 г; водяні - озерна (Rana ridibunda) і ставкова (Rana esculenta) масою 30 - 70 г.
Жаб містять протягом зими в басейні з проточною водою в напівтемному приміщенні при температурі від 3 до 8 ° C.
Вміщені в протягом зими в басейні жаби можуть бути відразу використані для досвіду. Навесні і влітку свіжоспійманих жаб витримують до початку досліду в басейні з проточною водою протягом 2 - 3 діб. Температура води в басейні в теплу пору року не повинна перевищувати 15 ° C. Приміщення лабораторії, в якій проводять біологічні випробування, повинно бути світлим, але захищеним від попадання прямих сонячних променів, температура повітря в ньому - 15 - 22 ° C. У лабораторії повинна знаходитися раковина для утримання піддослідних жаб, в яку їх поміщають за 1 - 1,5 год до проведення досвіду.
Техніка випробування і принцип розрахунку
Відбирають партію жаб одного виду, можливо близьких один до одного по масі. Зважування тварин проводять безпосередньо перед досвідом з точністю до 0,5 г з відхиленнями від середньої маси в групі не більше ніж на ± 2,5 г: 28 - 33, 30 - 35, 35 - 40 і до 65 - 70 м
Жаб по 5 штук зміцнюють на дошках черевцем догори з гранично витягнутими кінцівками, шпильки вколюють в верхню частину морди і в суглоби передніх і задніх кінцівок.
Пінцетом захоплюють шкіру на грудях і вирізують в ній трикутний отвір. Вирізаний клапоть шкіри відкидають в сторону. При цьому стає чітко видимою грудина, що просвічує через м'язи, у вигляді білої пластини, що нагадує за формою пісочний годинник. Піднявши пінцетом грудину в вузької частини, тонкими ножицями перерізають її поперек вище і нижче місця накладення пінцета, так що утворюється вузьке поперечне віконце, через яке видно дуги аорти і передсердя. Тонким (очним) пінцетом проникають в розріз (обережно, щоб не поранити передсердя і великі судини), злегка витягають серцеву сорочку і розсікають її ножицями. Потім легкими надавливаниями на черевце жаби виводять серце назовні. При препаруванні стежать за тим, щоб через утворений отвір не виступали назовні печінка і легені, і щоб серце вільне містилося на позбавленому шкіри ділянці, не торкаючись до зовнішньої поверхні шкіри. Протягом досвіду оголене серце кожні 15 - 20 хв змочують натрію хлориду розчином 0,6% (наносять піпеткою 2 - 3 краплі на оголене серце).
Випробування на трав'яних жаб слід проводити, вводячи розчини в лімфатичні стегнові мішки (під шкіру) або в серце (в порожнину шлуночка); на водяних жаб - в серці (в порожнину шлуночка) або в вену; під шкіру - тільки розчини, що містять глікозиди конвалії.
Жабам, що належать до однієї групи (5 штук), вводять однакові дози випробуваного розчину.
Випробовувані препарати попередньо розводять водою з таким розрахунком, щоб 0,3 або 0,4 мл випробуваного розчину містили 1 ЛІД. Для цього середня кількість одиниць дії лікарського засобу множать на кількість мілілітрів, відповідне 1 ЛІД. Наприклад, якщо в 1 мл препарату «Коргликон розчин 0,06% для ін'єкцій» міститься в середньому 13,3 ЛІД (13,3 · 0,3 = 3,99), то препарат слід розвести 1: 4.
- Метод випробування при введенні під шкіру. Розчини вводять шприцом з тонкою голкою в стегнові лімфатичні мішки жаб. Дози, які перевищують 0,35 мл, вводять в одну кінцівку, великі дози (але не більше 0,7 мл) вводять рівними частинами в обидві кінцівки.
Після введення розчину спостерігають за жабами і визначають найменшу дозу, яка викликає систолічну зупинку серця у більшості з 5 жаб даної групи протягом 1 год, якщо відчувають лікарську рослинну сировину і лікарські препарати наперстянки, конвалії, горицвіту; або протягом 2 ч, якщо відчувають лікарську рослинну сировину і лікарські препарати строфанта або желтушника. Якщо протягом цього часу виразною зупинки серця не відбулося, продовжують спостереження ще 10 хв (при тривалості спостереження 1 ч) і враховують також кількість жаб, у яких зупинка серця настала в додатковий час. Тривалість систолічною зупинки серця повинна бути не менше 15 хв. Жаб, у яких серце починає знову скорочуватися раніше, ніж через 15 хв після зупинки, в розрахунок не приймають.
У протоколах дослідів відзначають час введення ІЛС і результати дослідів для кожної жаби окремо. Кожне окреме випробування починають з визначення чутливості даної партії жаб до стандартним зразком. З цією метою кільком групам (по 5 жаб з однаковою масою тіла в кожній) вводять різні дози стандартного зразка: першої групи - дозу, відповідну 1 ЛІД (по 0,3 або 0,4 мл в залежності від зразка); іншим - на 0,05 - 0,1 мл більше. Знаходять найменшу дозу стандартного зразка, що викликає зупинку серця у більшості з 5 жаб. Якщо зупинка спостерігається у всіх жаб, то переходять до випробування меншої дози, а якщо зупинки були у одного або двох тварин або не спостерігалося взагалі, то доза ІЛС збільшується. Таким чином, визначається чутливість дослідній партії жаб в порівнянні зі стандартними жабами. Потім в тих же умовах досвіду групі з 5 жаб тієї ж партії вводять розчин ІЛС в дозі, що відповідає знайденої найменшою дозі стандартного зразка, і спостерігають за тваринами протягом 1 або 2 ч (в залежності від того, яке лікарський засіб випробовується). Якщо в результаті спостережень буде встановлено, що введена доза недостатня або занадто велика, дозу збільшують або зменшують, причому різниця між дозами повинна бути не більше 0,1 мл. Досліди проводять до тих пір, поки не буде знайдена найменша доза ІЛС, що викликає систолічну зупинку серця у більшості з 5 жаб.
Далі розраховують зміст одиниць дії (X) в 1 мл, 1 г або в 1 таблетці ІЛС.
Для лікарської рослинної сировини і лікарських препаратів наперстянки, конвалії, горицвіту розрахунок проводять за формулою:
де
A - найменша доза в мл, встановлена для розчину ІЛС;
B - найменша доза в мл, встановлена для розчину
стандартного зразка;
0,3 - доза в мл, що відповідає 1 ЛІД;
K - число, що позначає розведення ІЛС.
Для лікарської рослинної сировини і лікарських рослинних препаратів строфанта і желтушника розрахунок проводять за формулою:
- Метод випробування при введенні в порожнину шлуночка серця. Випробовувані розчини, попередньо звільнені від надлишку спирту (його концентрація не повинна перевищувати 10%) і летких речовин, у відповідному розведенні вводять жабам безпосередньо в порожнину шлуночка серця зі швидкістю 0,1 мл в 5 с, проколюючи його в момент діастоли тонкою голкою, з'єднаної зі шприцом з розподілом 0,02 мл. Голку виймають з порожнини шлуночка під час систоли, щоб уникнути кровотечі в місці уколу.
Для визначення найменшої дози розчину СО і ІЛС трав'яним жабам вводять приблизно 0,2 мл лікарського препарату наперстянки, конвалії, горицвіту або 0,3 мл лікарського препарату строфанта, желтушника. Допустиме відхилення між вводяться дозами - 0,02 мл.
При визначенні активності на водяних жаб розраховують вводиться дозу на 1 г маси тіла. Для того щоб не розраховувати кожен раз дозу на введення, пропонується таблиця розрахункових доз. Допустиме відхилення між вводяться дозами повинно бути не більше 0,0005 мл на 1 г маси жаби. Найменшими дозами зазвичай є 0,004 - 0,006 мл розчину на 1 г маси жаби.
Таблиця - Дози лікарського засобу в мл, розраховані для водяних жаб, при оцінці лікарських засобів, що містять серцеві глікозиди, при внутрішньосерцевому і внутрішньовенному шляху введення
Середня маса жаби, г Доза лікарського засобу на 1 г маси жаби, мл 0,0030 0,0035 0,0040 0,0045 0,0050 0,0055 0,0060 0,0065 0,0070 0,0075 30 0,09 0 , 10 0,12 0,14 0,15 0,17 0,18 0,20 0,21 0,23 35 0,11 0,12 0,14 0,16 0,18 0,19 0,21 0, 23 0,25 0,26 40 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0,30 45 0,14 0,16 0,18 0, 20 0,23 0,25 0,27 0,29 0,32 0,34 50 0,15 0,18 0,20 0,23 0,25 0,28 0,30 0,33 0,35 0,38 55 0,17 0,19 0,22 0,25 0,28 0,30 0,33 0,36 0,39 0,41 60 0,18 0,21 0,24 0,27 0,30 0,33 0,36 0,39 0,42 0,45 65 0,20 0,23 0,26 0,29 0,33 0,36 0,39 0,42 0,46 0,49 70 0,21 0,25 0,28 0,32 0,35 0,39 0,42 0,46 0,49 0,53 75 0,23 0,26 0,30 0,34 0,38 0,41 0,45 0,49 0 , 53 0,56
Тривалість спостереження за жабами - 15 хв, якщо відчувають лікарську рослинну сировину і лікарські препарати наперстянки, конвалії, горицвіту; для лікарських препаратів строфанта, желтушника - 20 хв. Якщо протягом цього часу виразною зупинки серця не відбулося, спостереження продовжують ще 5 хв. Жаб, у яких серце починає знову скорочуватися раніше, ніж через 5 хв після зупинки, в розрахунок не приймають.
Обчислюють вміст ЛІД в 1 мл, 1 г або в 1 таблетці випробуваного зразка за формулами, наведеними для підшкірного введення, але значення A і B залежать від принципу розрахунку доз, тобто від виду використаних жаб:
A - найменша доза (в мл на масу трав'яний жаби або в мл на 1 г маси водяної жаби), встановлена для розчину ІЛС;
B - найменша доза (в мл на масу трав'яний жаби або в мл на 1 г маси водяної жаби), встановлена для розчину стандартного зразка.
- Метод випробування при введенні в вену. У жаб проводять поперечний розріз шкіри на рівні ключиць, потім по середній лінії живота до симфізу, де надсекают шкіру вправо і вліво. Утворилися клапті шкіри відводять в сторони. На внутрішній поверхні після відведення в сторону клаптів шкіри з кожного боку видно велику шкірна вена у вигляді петлі, що йде по поверхні прямого м'яза живота від шкіри спини донизу, а потім знову вгору, де вона впадає у верхню порожнисту вену. Потім виводять назовні серце аналогічно методу випробування при введенні під шкіру. Дошку з групою препарованих жаб повертають так, щоб їхні голови були звернені до експериментатору для зручності введення голки в спадний коліно петлі вени жаби.
При внутрішньовенному введенні жабам розчинів СО і ІЛС у відповідному розведенні, звільнених від надлишку спирту і летких речовин, розраховують вводиться дозу на 1 г маси тіла (таблиця).
Які належать до однієї групи 5 жабам вводять в вену однакові дози розчину стандартного зразка або ІЛС тонкою голкою, з'єднаної зі шприцом місткістю 1 мл, зі швидкістю 0,1 мл за 5 с. Після кожного введення накладають кровоспинні затискачі, які не знімають до кінця досвіду. Час спостереження за зупинкою серця жаби - 15 хв, якщо відчувають лікарську рослинну сировину і лікарські препарати наперстянки, конвалії, горицвіту; для лікарських препаратів строфанта, желтушника - 20 хв. Якщо протягом цього часу виразною зупинки серця не відбулося, спостереження продовжують ще 5 хв; про результати судять по змінам, що наступає в додатковий час.
Визначення найменшої дози стандартного зразка і ІЛС, що викликає систолічну зупинку серця у більшості жаб з 5, проводять так само, як при введенні під шкіру. Допустиме відхилення між вводяться дозами повинно бути не більше 0,0005 мл на 1 г маси жаби.
Найменшими дозами зазвичай є 0,004 - 0,006 мл розчину на 1 г маси жаби.
Обчислюють вміст ЛІД в 1 мл, 1 г або в 1 таблетці ІЛС за формулами, наведеними для підшкірного введення, але з іншими позначеннями A і B:
A - найменша доза (в мл на 1 г маси жаби), встановлена для розчину ІЛС;
B - найменша доза (в мл на 1 г маси жаби), встановлена для розчину стандартного зразка.
Завантажити в PDF ОФС.1.2.4.0009.15 Біологічні методи оцінки активності лікарської рослинної сировини і лікарських препаратів
