1 стручку Г.Ю. 1 Драндрова Є.Г. 1 Меркулова Л.М. 1 Стоменская І.С. 1 Кострова О.Ю. 1
1 ФГБОУ ВО «Чуваська державний університет імені І.М. Ульянова »
В роботі досліджено морфофункціональний стан вилочкової залози потомства тварин з вродженим імунодефіцитом при постнатальному введенні 1,2-диметилгидразина. За допомогою общегістологіческіх і люмінесцентно-гістохімічних методів досліджено тимус щурів-самок в нормі, після введення канцерогену і на тлі імунодефіциту. Встановлено, що при розвитку аденокарциноми товстої кишки в вилочкової залозі спостерігаються значні морфофункціональні зміни, характерні для акцидентальной інволюції. Цей процес особливо виражений в групі тварин, які народилися від самок з імунодефіцитом. Прояв інволюції - зміна морфології часточки, достовірне зменшенням її морфометричних показників (діаметр коркового і площа мозкової речовини), виражений дисбаланс рівня серотоніну, гістаміну і катехоламінів у всіх її структурах з достовірним підвищенням індексу (серотонін + гістамін) / катехоламіни. Крім того, в 1,5 рази збільшується кількість гладких клітин з помірною і вираженою ступенем дегрануляції. Таким чином, можна зробити висновок, що попередній імунодефіцит у самок до вагітності позначається на морфофункціональних змінах залози у потомства. У зв'язку з цим розвивається індукована злоякісна пухлина швидше вислизає від імунного нагляду і стає більш агресивною з розвитком ранніх метастазів.
тимус
канцерогенез
вроджений імунодефіцит
інволюція
апоптоз
огрядні клітини
біогенні аміни.
1. Бережна Н.М. Фізіологічна система сполучної тканини і онкогенез. Роль клітинних компонентів строми в розвитку пухлини / Н.М. Бережна, В.Ф. Чехун // Онкологія. - 2016. - Т. 18, № 1. - С. 4-14.
2. Finn OJ Immuno-oncology: understanding the function and dysfunction of the immune system in cancer // Annals of oncology. - 2012. - Vol. 23, № 8. - P. 116-119.
3. Higashijima J. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice / J. Higashijima, M. Shimada, M. Chikakiyo et al. // Anticancer Res. - 2009. - Vol. 29, № 1. - P. 385-393.
4. Sonoda K. Decreased growth rate of lung metastatic lesions after splenectomy in mice / K. Sonoda, K. Izumi, Y. Matsui, M. Inomata, N. Shiraishi, S. Kitano // Eur. Surg. Res. - 2006. - Vol. 38, № 5. - P. 469-475.
5. Яглова Н.В. Вплив активації імунної системи материнського організму в ранні терміни вагітності на постнатальний морфогенез органів імунної системи потомства / Н.В. Яглова, С.С. Обернихина // Проблеми репродукції. - 2013. - № 1. - С. 73-77.
6. стручки Г.Ю. Морфологічна та імуногістохімічна характеристика тимуса при хімічному канцерогенезі, викликаному введенням 1,2-диметилгидразина / Г.Ю. Стручки, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичов // Морфологія. - 2014. - Т. 146. - № 5. - С. 35-39.
7. стручки Г.Ю. Морфологічна та імуногістохімічна характеристика пухлин шлунково-кишкового тракту на тлі імунної недостатності / Г.Ю. Стручки, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичов і ін. // Вісник чуваської університету. - 2011. - № 3. - С. 450-456.
8. стручки Г.Ю. Морфофункціональні зміни селезінки і тимусу щурят, народжених від спленектомірованних щурів-самок / Г.Ю. Стручки, Л.М. Меркулова, О.Ю. Кострова і ін. // Успіхи сучасного природознавства. - 2014. - № 9-2. - С. 70-72.
9. Драндрова Є.Г. Імуногістохімічні дослідження клітинного складу тимусу при канцерогенезі в умовах вторинного імунодефіциту / О.Г. Драндрова, Г.Ю. Стручки, Л.М. Меркулова і ін. // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2015. - № 3. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=19825 (дата звернення: 10.02.2018).
10. Elenkov IJ Stress System Organization, Physiology and Immunoregulation / IJ Elenkov, GP Chrousos // Neuroimmunomodulation. -2006. - Vol. 13. - P. 257-267.
11. Сімбірцев А.С. Цитокіни в лабораторній діагностиці / А.С. Сімбірцев, А.А. Тотолян // Клінічна лабораторна діагностика: національне керівництво / під ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова. - М .: ГОЕТАР-Медіа, 2012. - Т. 2. - С. 193-229.
12. Hellstrand K. Histamine in cancer immunotherapy: a preclinical background // Semin. оncol. - 2002. - V. 29, N 3. - P. 35-40.
13. Москвичов Є.В. Морфологічна та імуногістохімічна характеристика вилочкової залози при експериментальному канцерогенезі в умовах вторинної імунної недостатності: автореф. дис. ... докт. мед. наук. - Оренбург, 2013. - 30 с.
Зараз не викликає сумнівів, що розвиток як фундаментальної, так і практичної онкології обумовлено успіхами в молекулярній генетиці і імунології. В результаті цього ми наблизилися до розуміння сутності та особливостей формування протипухлинного захисту від стадії розпізнавання пухлинних антигенів до етапу реалізації знищення пухлини. Крім того, відбулася зміна ряду поглядів на взаємовідношення пухлини і клітин системи імунітету [1]. Таким чином, можна зробити висновок, що сучасна онкоіммунологія переживає переосмислення деяких тверджень і понять, прийнятих раніше, а саме, що онкологічні захворювання - не патологія імунної системи, на відміну від алергічних і аутоімунних захворювань, при яких порушення імунітету є основною причиною розвитку хвороби. Встановлено також, що при розвитку пухлини зміни з боку імунітету часто викликані впливом вже виникла пухлини, тобто вторинні [1].
Інтерес і актуальність дослідження механізмів роботи системи імунітету обумовлені сучасними запитами практичної медицини і пов'язані з можливістю профілактики розвитку різних захворювань. Вивченість механізмів роботи системи імунітету до цих пір недостатня. Це пов'язано, перш за все, з кооперацією великої кількості клітин в імунних реакціях, а також з недоліком доступних методів їх виявлення [2].
Встановлено, що колоректальний рак є однією з найбільш поширених пухлин з різним метастазированием в легені, печінку і інші органи [3]. Агресивне зростання і досить швидке метастазування колоректального раку дуже часто пов'язують з порушенням протипухлинної активності через попереднього видалення селезінки [3; 4].
Крім того, виявлено, що зниження протипухлинного імунітету у потомства гризунів пов'язано з дисбалансом імунної системи щура в перші місяці вагітності [5]. Доведено, що в патогенезі розвитку пухлини в організмі тварин має принципове значення серйозний дисбаланс ендокринної системи: виражена атрофія тимуса з деструкцією епітеліальних клітин, структур оточення коркового і мозкового речовини, а також гальмування тімопоеза [6]. Однак в літературі зустрічається багато інформації про те, що сама імунна недостатність організму сприяє розвитку агресивнішою пухлини з формуванням ранніх метастазів [7].
Саме тому вивчення морфофункціональних особливостей як імунних, так і ендокринних органів на різних рівнях у потомства тварин з вторинним імунодефіцитом, а також розробка ефективних способів корекції імунодефіциту в організмі матері для отримання здорового потомства є досить актуальним і пріоритетним.
Мета дослідження - дослідження морфофункціонального стану вилочкової залози потомства тварин з вродженим імунодефіцитом при постнатальному введенні 1,2-диметилгидразина.
Матеріал і методи
Експерименти проведені на нелінійних білих щурах (n = 100). Догляд за тваринами, які містилися у віварії, здійснювався відповідно до «Правилами проведення робіт з використанням експериментальних тварин». Дослідження проводилися на 4 групах тварин: 1) інтактний контроль (потомство здорових самок, n = 25), 2) контрольна група (потомство спленектомірованних щурів, n = 25), 3) перша піддослідна група (потомство здорових самок, яким через 1 місяць після народження починали вводити канцероген (1,2-диметилгидразин) з розрахунку 20 мг / кг 1 раз на тиждень протягом 4 тижнів, n = 25), 4) друга піддослідна група (потомство спленектомірованних самок, яким через 1 місяць після народження починали вводити 1 , 2-диметилгидразин з розрахунку 20 мг / кг 1 раз на тиждень протягом 4 тижнів, n = 25).
При вивченні потомства піддослідних груп відзначено, що розвиток імунодефіциту у самок не впливає на формування статі щурят. У всіх досліджуваних групах народжувалося 55-60% самок і 40-45% самців. Розвиток пухлини товстої кишки на тлі введення канцерогену у щурят обох статей відбувалося в однаковому відсотку випадків. Умертвіння тварин проводили шляхом декапитации через 6 місяців після закінчення курсу введення 1,2-диметилгидразина.
Під час розтину тварин всіх груп проводилася ревізія органів грудної та черевної порожнини з обов'язковим дослідженням товстої кишки. Патоморфологічне дослідження включало в себе вивчення частоти розвитку злоякісних новоутворень, їх локалізацію та морфотіпірованіе. Тварини, у яких пухлина не формувалася, в дослідження не включалися.
При морфофункциональном дослідженні вилочкової залози нами використовувалися наступні методи.
- Забарвлення гематоксиліном і еозином. Орган фіксувався в 10% -ному нейтральному формаліні протягом доби, промивали в проточній воді, і потім виконувалася стандартна проводка на тканинному гістопроцессоре Leica ASP 200 (Leica, Німеччина). Парафінові зрізи тимуса наносили товщиною 3 мкм на скла Mentzel Glasses super frost (Німеччина) і фарбували гематоксиліном та еозином за стандартною методикою.
- Люмінесцентно-гістохімічних метод Хілларпа-Фалька використовувався для виявлення норадреналіну і серотоніну в структурах тимуса. Кріостатних препарати вивчалися під люмінесцентним мікроскопом ЛЮМАМ-4 протягом двох діб.
- Люмінесцентно-гістохімічних метод Кросу-Евена-Роста проводився для виявлення структур вилочкової залози, що містять гістамін. Кріостатних зрізи органу вивчалися протягом доби за допомогою люмінесцентного мікроскопа ЛЮМАМ-4.
- Для визначення рівня норадреналіну, серотоніну і гістаміну в структурах тимуса застосовувався метод цітоспектрофлуоріметріі. Кількісні показники вимірювалися за допомогою насадки ФМЕЛ-1А, яка встановлювалася на мікроскоп ЛЮМАМ-4. Рівень вище перерахованих медіаторів в люминесцирующих клітинах тимуса визначали в умовних одиницях (одиниці флюоресценції за шкалою вольтметра). Для оцінки функціонального стану структур тимуса вираховувався індекс (серотонін + гістамін) / катехоламіни. Збільшення цього співвідношення вказує на пригнічення фізіологічної активності клітин, зниження цього індексу свідчить про їх стимуляції [5].
- Забарвлення по Унна з використанням полихромного толуїдинового синього застосовувалася для вивчення якісного і кількісного складу огрядних клітин вилочкової залози. При мікроскопії огрядних клітин враховувалася їх ступінь дегрануляції. Виділяли недегранулірованние, слабо, помірно і сильно дегранулірованние мастоцити.
- Комп'ютерна морфометрія. За допомогою системи архівування на мікроскопі Leica DM4000B (Leica, Німеччина) отримували оцифровані фотографії препаратів з використанням фотокамери Leica DFC 425 і ліцензійної програми Leica Application Sute 3.6.0 (Leica, Німеччина). Морфометрія площі мозкової речовини і товщини коркового речовини часточок вилочкової залози виконувалася з використанням цієї ж програми.
Статистичну значимість отриманих даних визначали по t-критерієм Стьюдента. Дані представляли у вигляді середньої арифметичної величини (M) і її середньої помилки (m).
Результати дослідження та їх обговорення
Наші експерименти показали, що введення канцерогену призводить до формування передракових змін, таких як проліферація крипт товстої кишки і клітинна дисплазія різного ступеня. На тлі цього через 6 місяців формується аденокарцинома помірною і низькою диференціювання.
При морфологічному дослідженні було відзначено, що тимус щурів на тлі розвитку злоякісної пухлини достовірно відрізняється від такого в контрольній групі. Встановлено, що у інтактних тварин часточки тимуса частіше мають овальну форму і розділені междольковимі перегородками, в межах яких іноді виявляються невеликі кількості жирової тканини. Корковаречовина представлено в основному лімфоцитами, всередині яких добре помітно ядро діаметром від 2,7 до 3,6 мкм і ядерце в центрі. Зустрічаються також більші тімоціти з діаметром ядра від 3,8 до 4,9 мкм і базофільною цитоплазмою по периферії. Іноді виявляються великі лімфоцити неправильної форми з великим ядром (до 5,4 мкм) і вузьким обідком оксифильной цитоплазми. У кірковій речовині виявляються кровоносні судини, які спрямовані від мозкової речовини на периферію часточки променеподібно в междолькових септах. Мозкова речовина також в основному представлено лімфоцитами з великим ядром діаметром від 3,5 до 4,8 мкм і з вузькою базофільною цитоплазмою на периферії.
У потомства самок з попередньої спленектомією, яким вводили канцероген, відзначали зменшення тимуса в масі і розмірах, стирання межі між кірковим і мозковим речовиною, заміщення паренхіми залози жировою тканиною.
На периферії вилочкою залози часто виявляються ділянки скупчення епітеліальних клітин з малою кількістю лімфоцитів, які оточені жировим прошарком. У центрі тимуса візуалізуються невеликого розміру часточки, в мозковій речовині яких визначаються скупчення епітеліоцитів. При морфометрії реєструється зниження площі мозкової речовини майже в 2 рази і товщини коркового речовини на 22,3%. Маса тимуса зменшується не настільки значно - на 20%, що можна пов'язати з заміщенням робочої паренхіми органу жировою тканиною.
Люмінесцентно-гистохимическое дослідження вилочкової залози підтверджує общегістологіческую картину: відзначається стирання кордонів між тимусні часточками, междольковие септи розширені і містять жирову тканину. Обробка препаратів ортофталіевим альдегідів за методом Кросу на гістамін дозволила зареєструвати переважання інтенсивності люмінесценції мозкової речовини над кірковим. Кількість люминесцирующих гранулярних клітин і їх розміри в порівнянні з групою інтактного контролю зменшено.
Використання цітоспектрофлуоріметріі дозволило встановити, що рівень серотоніну в люминесцирующих гранулярних клітинах (ЛГК) коркового речовини і в огрядних клітках достовірно знижується, інтенсивність люмінесценції катехоламінів в лімфоцитах коркового і мозкового речовини також зменшується, а вміст гістаміну в клітинах кортико-медулярної зони, огрядних клітках і лімфоцитах мозкової речовини, навпаки, достовірно вище, ніж в групі інтактного контролю (таблиця).
Рівень серотоніну (СТ), гістаміну (ГСТ) і катехоламінів (КА) (в ум. Од.) В клітинах тимуса щурів интактного контролю, контрольної та дослідних груп
структури тимуса
інтактний контроль
контрольна група
Перша дослідна група
Друга дослідна група
ЛГК кортико-медулярної зони
СТ
512,23 ± 12,3
532,7 ± 9,2 *
275,5 ± 17,6 **
341,5 ± 8,2 **
ГСТ
542,5 ± 3,4
601,2 ± 4,4 **
1221,0 ± 31,2 **
984,3 ± 12,4 **
КА
192,7 ± 5,8
184,5 ± 7,4
208,6 ± 10,3 *
168,2 ± 9,8 *
ЛГК субкапсулярной зони
СТ
288,8 ± 2,3
309,6 ± 3,9 **
248,7 ± 17,8 *
232,3 ± 21,8 **
ГСТ
442,8 ± 9,5
497,4 ± 4,8 **
668,7 ± 22,6 **
478,1 ± 6,4
КА
172,3 ± 1,8
185,7 ± 3,3 *
154,4 ± 7,8 *
188,2 ± 8,1
Лімфоцити коркового речовини
СТ
228,1 ± 1,8
252,9 ± 2,3 **
198,1 ± 9,2 *
254,4 ± 7,5
ГСТ
442,7 ± 5,8
468,1 ± 2,2 **
421,2 ± 9,1 *
499,8 ± 8,8 **
КА
152 ± 7,4
165,3 ± 5,1
140,0 ± 6,1
125,1 ± 3,4 **
Лімфоцити мозкової речовини
СТ
185,7 ± 5,2
202,3 ± 4,6 **
168,9 ± 4,8
148,6 ± 5,2 **
ГСТ
221,7 ± 2,3
239,8 ± 1,7 **
224,5 ± 8,7
589,4 ± 15,3 **
КА
141,8 ± 2,6
150,3 ± 3,43 *
146,9 ± 4,5
126,8 ± 2,3 *
гладкі клітини
СТ
262,9 ± 1,5
297,3 ± 3,1 **
78,3 ± 3,5 **
105,8 ± 9,3 **
ГСТ
532,9 ± 8,9
530,7 ± 6,5
521,7 ± 5,3
614,8 ± 5,5 **
КА
168,6 ± 2,8
167,2 ± 2,2 *
86,0 ± 2,7 **
209,1 ± 5,2 *
* - Р <0,01; ** - Р <0,001 у порівнянні з щурами интактного контролю.
Обчислюється нами індекс (серотонін + гістамін) / катехоламіни в клітинах кортико-медулярної зони, тимоцитах коркового і мозкового речовини зростав на 21, 35 і 104% відповідно. У клітинах субкапсулярной зони і огрядних клітках це співвідношення, навпаки, знижувався на 10 і 33% відповідно.
На зрізах, забарвлених толуїдиновим синім по Унна, візуалізуються розширені междольковие сполучнотканинні перегородки з огрядними клітинами різного ступеня дегрануляції. У другій дослідній групі виявляється в середньому 7-10 огрядних клітин, що в більш ніж в 1,5 рази вище, ніж у інтактних щурів. Мастоцити з помірною і вираженою ступенем дегрануляції складають більше половини всіх огрядних клітин.
Отже, нами виявлено, що при розвитку аденокарциноми товстої кишки в вилочкової залозі спостерігаються значні морфофункціональні зміни, характерні для різних стадій акцидентальной інволюції. Цей процес особливо виражений в групі тварин, які народилися від самок з імунодефіцитом. Прояв інволюції - зміна морфології часточки, достовірне зменшенням її морфометричних показників, виражений дисбаланс рівня серотоніну, гістаміну і катехоламінів у всіх її структурах з достовірним підвищенням індексу (серотонін + гістамін) / катехоламіни. Крім того, в наших попередніх дослідженнях з використанням поліклональних антитіл зареєстровано зниження клітинної проліферації тимоцитів як коркового, так і мозкової речовини, зменшення кількості епітеліальних клітин в тимусних часточках, збільшення числа дендритних клітин, макрофагів і клітин АПУД-серії [8]. Крім цього, в тимусі виявляється збільшення числа клітин, що експресують білок апоптозу P-53 і зниження bcl-2 + -клітин [9].
Як відомо, серотонін, катехоламіни і гістамін роблять виражений вплив на багато фізіологічні процеси в органах і тканинах. Катехоламіни, наприклад, активують Т-хелпери, стимулюють антитілоутворення, підсилюють функціональну активність гладких клітин, а також впливають на активність клітин моноцитарно-макрофагальної системи [10]. Крім того, вони є індукторами як гуморального, так і клітинного імунітету, впливаючи на продукцію протизапальних цитокінів в крові [11]. Серотонін, поряд з норадреналіном, посилює взаємодію клітин імунної системи і їх міграцію, активує фагоцитоз і продукцію інтерлейкінів [11]. Гістамін ж, навпаки, гальмує фагоцитоз і дегрануляцію тучних клітин, пригнічує роботу клітин гуморального імунітету [12]. Беручи участь в клітинному імунітеті, гістамін посилює цитотоксичність Т-клітин і природних кілерів [12; 13].
Погоджуючи з літературними даними, зареєстроване нами збільшення індексу (серотонін + гістамін) / катехоламіни практично у всіх структурах тимуса, і особливо в лімфоцитах коркового і мозкового речовини, буде свідчити про пригнічення функціональної активності і подальшому розвитку акцидентальной інволюції залози.
В даний час немає сумнівів, що розвивається злоякісна пухлина і тимус надають один на одного взаємний вплив. Так як більшість пухлин є тімусзавісімих, то їх розвиток практично завжди супроводжується інволютивними змінами в залозі. Це виявляється і при злоякісному рості, в тому числі з використанням хімічних канцерогенів [7]. Доведено, що при канцерогенезі індукується викид з вилочкової залози незрілих Т-лімфоцитів, які направляються в осередок злоякісного росту і підтримують зростання перероджуються клітин [9]. Надходження тимусних лімфоцитів в пухлину сприяє посиленню активності зростання як самих пухлинних клітин, так і судин шляхом продукції фактора росту ендотелію [6].
Таким чином, вивчивши гістологічну картину, зміст біогенних амінів і иммуногистохимический фенотип тимуса, можна зробити висновок, що попередній імунодефіцит у самок до вагітності позначається на морфофункціональних змінах залози у потомства. У зв'язку з цим розвивається індукована злоякісна пухлина швидше вислизає від імунного нагляду і стає більш агресивною з розвитком ранніх метастазів.
бібліографічна ПОСИЛАННЯ
Стручки Г.Ю., Драндрова Є.Г., Меркулова Л.М., Стоменская І.С., Кострова О.Ю. ОБЩЕГІСТОЛОГІЧЕСКОЕ і люмінесцентні-гістохімічне дослідження тимус ЩУРІВ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ канцерогенезу В УМОВАХ ВРОДЖЕНОГО імунодефіциту // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2018. - № 2.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27446 (дата звернення: 18.07.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, что видають у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?Ru/ru/article/view?
