Аналіз в режимі реального часу вихідних даних описаний на малюнку 1. По-перше, тромбоцити прилипають до реактивної поверхні, що призводить до постійного збільшення записаної зеленої флуоресценції (рис 1А, I), називається адгезією. Під час цієї фази, існує мало фіалка флуоресценції, вказуючи, що фібрин НЕ або лише слабо сформовані (Фігура 1В). При ініціації коагуляції, фіолетово-флуоресціюючих відкладення фібрину швидко (III), і протягом цього часу, тромбоцитів зеленої флуоресценції зростає при приблизно з тією ж швидкістю, що позначаються тут як накопичення тромбоцитів (II). Таким чином, один експеримент повертає три темпи зростання флуоресценції (I, II, і III) в якості сурогатного маркера для швидкості, при якій тромбоцитів і фібрину осадження відбувається в цій моделі. Крім того, момент початку коагуляції (про момент початку (IV)) екстраполюється, що є визначальним фактором тромбоцітовпрокоагулянтное потенціал.
При відсутності TF, ініціація згортання відбувається повільно і в основному проходить через контактний шлях, де внутрішня Тенасе комплекс активує FX за допомогою прямої активації FIX 6 за допомогою FXI і / або FXII. Щоб продемонструвати FXII залежність, 4 мкМ інгібітора трипсину кукурудзи (CTI) додавали для пригнічення активованого FXII (FXIIa) 7. Це інгібування не впливає на адгезію тромбоцитів (фіг.2), але коагуляція не розпочинав для довільно заданої загальної тривалості перфузионной експерименту (рис 2B і додаткового відео 1).
У пробірці, контактний шлях може бути ініційована сторонніх матеріалів, як скло, або в клінічних аналізах з використанням мінерального матеріалу, як каолін. У природних умовах, активовані тромбоцити забезпечують негативний заряд 8 </ SUP> через мембрану впливу кислих фосфоліпідів 9, як фосфатидилсерин, і / або за допомогою вивільнення поліфосфатів (поліп) 10,11. Наші мікрофлюідальние в режимі реального часу аналізу наслідує останнього, тому що, в діапазоні концентрацій тромбоцитів, гемостатический реакція залежала від кількості тромбоцитів (рисунок 3). За рахунок збільшення кількості тромбоцитів у розведеному зразку, швидкість адгезії (рис 3А), накопичення (фігура 3В, зелений), і коагуляція (фігура 3В, фіалка) лінійно зростає. Щодо моменту початку значно вкорочені (3в) при збільшенні концентрації тромбоцитів, припускаючи, що граничне число (активоване), обложених тромбоцитів потрібно, щоб викликати коагуляцію.
Після пошкодження тканини в природних умовах, проте, клітини TF-підшипник яnitiate згортання крові через FVIIa-TF примесного Тенасе комплексу в присутності іонів Са 2+. Це імітується в нашій експериментальній установці шляхом подальшого нанесення покриття на колаген-містять перфузійні камери з ліпідірованного rhTF. У парного аналізу каналів, покритих тільки або в комбінації з rhTF колагену, коагуляція початок був значно швидше (фіг.4). Швидкість адгезії тромбоцитів була лінійної, тому ніякої лінійної регресії не може бути виконана (дані не показані). І швидкість коагуляції і накопичення тромбоцитів не відрізнялися від умов (4В-4С, Додаткове відео 2).
Малюнок 1: Результати регресійного аналізу адгезії тромбоцитів і коагуляції в мікрофлюідальних перфузійних камерах. На цьому малюнку уточнюються параметри, отримані з реального часу флуоресценції вихідних даних придбані протягом рекальціфіцірованной кровотоку над реактивної поверхні. (А) Середня інтенсивність зеленої флуоресценції показує відкладення тромбоцитів в залежності від часу перфузії. Крива описує бімодальне процес, що починається з (I) повільно зростаючу лінійну адгезію тромбоцитів з подальшим (II) швидко зростаючого лінійного накопичення. Обидві лінійні частини кривої регрес і нахил їх описує дві швидкості формування тромбу шляхом тромбоцитів флуоресценції; (Я) адгезія і (б) накопичення. (Б) середня інтенсивність флуоресценції показує фіолетовою відкладення фібрину в залежності від часу. Під час адгезії тромбоцитів, фіолетовий флуоресцентний практично відсутня, в той час як він швидко розвивається після початку коагуляції. (IV) про момент початку визначається як перетину з віссю х екстраполювати лінійної регресії (III) на другому етапі формування тромбу фибрином флуоресценції позначеної тут як коагуляції. еф = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" цільових = "_blank"> Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 2: При відсутності TF, згортання в колагенових покриттям камер перфузия потоку залежить від FXIIa. Мікрожідкостних перфузия водостійких крові, що містить CTI або управління буфером (контроль) проводили при швидкості зсуву 1000 с -1 в цілому 30 хв. (А) Швидкість адгезії тромбоцитів (с -1) не залежить від ІТК. (В) про момент початку для ІТК-оброблених зразків було за межею 30 хв експерименту (показаний пунктирною лінією), що демонструє залежність від FXIIa цього параметра. Бари і точки є середніми значеннями, Вуса стандартне відхилення. Статистичний аналіз був по парного критерію Стьюдента. (NS = не має істотного значення, п ≥3). Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 3: коагуляція в потоці залежить від кількості тромбоцитів. Мікрожідком експерименти перфузійні були виконані в колагенових покриттям камерах з розлученою крові в присутності іонів Са 2+ і різних концентрацій тромбоцитів (п ≥3). (А) Ступінь адгезії тромбоцитів (B) швидкість накопичення тромбоцитів (зелений) і коагуляції (фіолетовий) і (С) про момент початку показані як функції концентрації тромбоцитів в розлученою крові. Точки є середніми значеннями, Вуса стандартні відхилення. Будь ласка , Натисніть тут , щоб побачити збільшене Versi на цій фігурі.
Малюнок 4: Активація обох TF і контактний зачіпає шляху коагуляції значно вкорочує про момент початку коагуляції. Водостійких крові, в присутності іонів Са 2+, вливають через камери, покритий одним або з колагеном і rhTF вчитися самостійно контактного шляху або комбінацію контактних і TF шляхів колагену. (A) про момент початку коагуляції істотно скорочується в TF-містять проточних камер. (B) Швидкість накопичення тромбоцитів в процесі коагуляції і (С) швидкість коагуляції значуще не відрізняються між колагеном або тільки колагеном і rhTF покриттям камери потоку. Бари і точки являють собою середні значення; ниткоподібні кристали являють собою стандартні відхилення. Статистичний аналіз був по парного критерію Стьюдента. (NS = не має істотного значення, * P <0,05, п ≥3). Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Додаткове відео 1: При відсутності TF, згортання в колагенових покриттям камер перфузия потоку залежить від FXIIa. Роль контактного шляху визначається в колагенових покриттям камер перфузия потоку. (A), накладене послідовність флуоресцентного зображення тромбоцитів (зелений) і фібрину (фібрину) (фіолетовий) осадження при відсутності CTI. (В) тій же послідовності, як панелі А, але з зеленого каналу вимкнений. (C), накладене послідовність флуоресценції зображення тромбоцитів (зелений) і фібрину (фібрину) (фіолетовий) осадження в присутності ІТК. (D), і ту ж послідовність, як панелі С, але з зеленого каналу виключен.ecsource.jove.com / files / ftp_upload / 55351 / Supplementary_video_1.avi "цільових =" _blank "> Будь ласка, натисніть тут, щоб завантажити це відео .
Додаткове відео 2: Активація обох TF і контактний шлях значно вкорочує коагуляционной про момент початку. Для вивчення ролі TF, використовувалися проточних камер, покритий одним або з колагеном і rhTF колагену. (A), накладене послідовність флуоресцентного зображення тромбоцитів (зелений) і фібрину (фібрину) (фіолетовий) осадження в проточних камерах, покритих тільки з колагеном. (В) тій же послідовності, як панелі А, але з зеленого каналу вимкнений. (C), накладене послідовність флуоресценції зображення тромбоцитів (зелений) і фібрину (фібрину) (фіолетовий) осадження в проточних камерах, покритих колагену і rhTF. (D) тій же послідовності, як панелі С, але з зеленим каналу пехед геть. Будь ласка , Натисніть тут , щоб завантажити це відео.
