Лікарсько - індукована тромбоцитопенія (МІТ) - загрозливе життя стан, який часто буває не розпізнано. Клінічні критерії дозволяють запідозрити наявність цього стану, проте потрібне підтвердження діагнозу з виявленням антитіл до тромбоцитів. Методика повинна бути в змозі підтвердити таку інформацію 1) зв'язок з медикаментом; 2) здатність антитіл зв'язуватися з тромбоцитами; 3) в ідеалі повинна відтворюватися в усіх лабораторіях.
Даний документ створений для поліпшення стандартизації лабораторної діагностики імунної тромбоцитопенії, що розвивається у відповідь на прийом найбільш поширених лікарських препаратів: хінін, ванкоміцин, сульфаметоксазол / тріметапрім, а також піперіціллін / тазобактам. Рекомендації засновані на досвіді роботи референсних лабораторій в США, Канаді та Німеччині.
рекомендації
1. Забір зразків крові.
Час забору крові: забір зразка крові повинен здійснюватися в гострому періоді тромбоцитопенії як тільки виникла підозра на наявність МІТ. Якщо до моменту дослідження тромбоцитопенія вирішилася, рекомендується використання зразків крові, взятих у пацієнта раніше під час гострої фази захворювання (якщо це можливо). Аналіз може проводитися протягом 3 тижнів після гострої фази тромбоцитопенії, в подальшому чутливість тесту знижується.
Антикоагулянт в зразку: для проведення дослідження підходить сироватка після згортання крові або зразки крові з цитратом. Додавання ЕДТА слід уникати, оскільки ця речовина може викликати формування глікопроетінових комплексів (включаючи глікопротеїн IIb / IIIa), пов'язуючи антитіла проти GP IIb / IIIa. Якщо проби з ЕДТА зберігаються, вони можуть бути використані для аналізу після проведення рекальцификации.
2. Підготовка тромбоцитів до дослідження.
Для проведення тесту потрібна наявність тромбоцитів (як субстрат для зв'язування антитіл). Очищені глікопроетіни тромбоцитів не можуть бути використані з цією метою, оскільки вони змінюють свою третинну структуру, а, отже, і антигенні властивості.
Джерело тромбоцитів: або свежевиделенние тромбоцити з крові здорових донорів, або тромбціти, що зберігаються в 0,1% розчині азида натрію. У разі використання «свіжих» тромбоцитів, кров повинна бути взята у донора методом вкрай акуратним аспірації (не за допомогою вакутейнер) через голку діаметром 21G (Діаметр вироби 0,8 мм, а довжина - 40 мм, прим. Перекладача); донор повинен бути в положенні сидячи. Накладення джгута слід уникати зовсім, або накладати його дуже щадне для уникнення активації тромбоцитів in vivo.
У донора повинні бути відсутніми супутні захворювання. Протягом як мінімум 7 днів донори не повинні приймати будь-які досліджувані препарати, які можуть будь-яким чином впливати на функцію тромбоцитів (включаючи НПЗЗ і інші протизапальні препарати). Донори повинні мати першу (О) групу крові і експресувати антигени HPA-1a для того, щоб в якості позитивного контролю можна було використовувати анти-HPA-1a антитіла. Кров для виділення тромбоцитів повинна міститися в цитрат, розчини CPD, ACD-A або ACD-B. Виділення тромбоцитів повинно здійснюватися шляхом обережного центрифугування (120хg, 20 хв, при кімнатній температурі). Пелети для центрифугування слід двічі промивати в фосфатному буферному розчині (PBS). Число тромбоцитів в кінцевому підсумку повинно бути доведено до 500х106 / мл з використанням фосфатного буфера.
3. Методи визначення
Для виявлення антитіл може бути використані як проточна цитометрії, так і імуно-ферментний аналіз.
Проточна цитометрії: тромбоцити здорового донора виділяються і инкубируются з досліджуваної плазмою в присутності і у відсутності лікарського препарату. Потім тромбоцити відмиваються буферним розчином, що містить лікарський препарат в тій же концентрації. Після відмивання тромбоцитів лікарсько-залежні тромбоцит-асоційовані імуноглобуліни визначаються за допомогою проточної цитометрії (використовуючи антитіла IgG і IgM до людських антигенів з флуоресцентними мітками). Аналогічно проводиться тест для середовища без лікарського препарату (тромбоцити відмиваються буфером без ліків) для підтвердження специфічності реакції.
Імуноферментний аналіз: тромбоцити ізолюються з крові здорових донорів і поміщаються в лунки мікроплашек. Досліджувана сироватка інкубується з тромбоцитами в присутності лікарського препарату і буфера. Після відмивання тромбоцитів антитромбоцитарні антитіла визначаються з використанням пов'язаних з ферментами молекул антитіл IgG та IgM до людських антигенів.
4. Зразки від пацієнта і контрольні зразки
Досліджувані зразки (а також позитивний і негативний контроль) повинні бути досліджені з / без лікарського препарату в однаковій концентрації.
Концентрація препарату і його розчинність. Лікарські препарати повинні бути використані як мінімум в терапевтичної концентрації, хороша стартова концентрація 1 мг / мл (таблиця 1).
Таблиця 1. Терапевтичні концентрації основних препаратів, тестованих на МІТ.
* - концентрація залежить від часу, дози і способу введення
Незважаючи на те, що супратерапевтіческая концентрація ванкоміцину 1 мг / мл може давати хибно-позитивну реакцію з нормальною контрольної сироваткою, використання такої концентрації дозволяє отримати водний розчин погано розчинних препаратів (сульфіт).
Тестований лікарський препарат повинен також обов'язково бути присутнім в розчинах, якими відмивають тромбоцити, щоб уникнути дисоціації лікарсько-залежних антитіл на етапі відмивання.
Розчинність ряду лікарських препаратів може ускладнювати проведення дослідження. Наприклад, сульфаметаксазол і триметоприм слабо розчинні у водних розчинах з нейтральної рН. Для отримання розчинів лікарських речовин більшої концентрації можуть бути використані спиртові розчини лекарствеених препаратів (розведені потім буфером), або лікарські речовини, розчинені в буфері з використанням перемішування і додаванням розчину 0,1 ммоль / л NaOH або HCl для підтримки pH. Ефективним способом підвищення розчинності сульфаметаксазол (і підвищення концентрації розчину до 1-2 мг / мл) є розчинення препарату в буфері, що містить 5% бичачого альбуміну.
Сироватки для позитивного контролю: ідеальної сироваткою для позитивного контролю є сироватка пацієнта з доведеною медикаментозно-індукованої тромбоцитопенией з наявністю антитіл, специфічних для досліджуваного ліки. Зазвичай такі сироватки рідко бувають доступні. Прийнятна альтернатива - сироватка від пацієнта з МІТ, специфічна по відношенню до іншого лікарського препарату, або сироватка, яка містить анти-НРА-1а антитіла (стандарт ВООЗ 106/05, або місцево підтверджений позитивний контроль на антитіла до тромбоцитів), щоб, як мінімум, забезпечити, щоб реєструвався позитивну відповідь на зв'язування антитіл. Якщо використовується анти-НРА сироватка, слід використовувати тромбоцити від НРА-1а позитивних донорів для того, щоб уникнути помилково негативні результати.
Сироватки для негативного контролю: ідеальна контрольна сироватка - це сироватка пацієнта, який отримує той же лікарський препарат, що і досліджуваний пацієнт, але у нього немає тромбоцитопенії. З огляду на, що така сироватка не завжди доступна, може бути використана сироватка здорового донора. Крім того, дослідження сироватки пацієнта без додавання лікарського препарату є важливим кроком для підтвердження залежності імунної реакції від цих ліків.
5. Інтерпретація результатів.
Тест на наявність лікарсько-залежних антитромбоцитарних антитіл розцінюється як позитивний, якщо в зразках сироватки пацієнта виявляється зв'язування антитіл з тромбоцитами в присутності лікарського препарату, і не виявляється під час відсутності препарату. Різниця в значеннях інтенсивності флуоресценції (при проведенні цитометрії) або оптичної щільності (імуноферментний аналіз) має бути як мінімум в 2 стандартних відхилення від значень, отриманих в зразках без додавання лікарського препарату. Іншим підходом є розрахунок частки від розподілу значень інтенсивності флуоресценції або оптичної щільності, отриманих з ліками, на значення в пробах без ліків. Значення приватного більше 1,5 є відрізний точкою для позитивного результату. Проте, кожна лабораторія повинна встановити власні відрізні точки шляхом тестування 10-20 зразків сироватки здорових донорів і проведення статистичного аналізу отриманих даних.
Позитивний результат тесту на виявлення лікарсько-залежних антитромбоцитарних антитіл характеризується високою специфічністю. Т.ч., пацієнти з позитивним результатом дослідження в майбутньому повинні уникати прийому відповідного препарату. Негативний результат не виключає наявності синдрому, що призводить до низької чутливості тесту зі специфічним лікарським препаратом. Можливі причини помилково негативні результати: 1) причиною МІТ є не самі ліки, а його метаболіт; 2) погана розчинність ліки і неможливість приготувати його розчин для дослідження; 3) відстрочений аналіз (після дозволу тромбоцитопенії), коли рівень антитіл знизився або вони зникли зовсім; 4) інша причина тромбоцитопенії (в тому числі, індукування іншими ліками). У пацієнтів, у яких МІТ підозрюється з високою ймовірністю, але результат тесту негативний, необхідно акуратно спробувати повторний прийом ліків. Це може бути корисно в тому випадку, якщо препарат використовується часто (наприклад, ацетамінофен).
За матеріалами:
Donald M. Arnold, Brian R. Curtis, Tamam Bakchoul; for the Subcommittee of Platelet
Immunology of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Recommendations for standardization of laboratory testing for drug-induced immune thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. 'Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015. Accepted Article, doi: 10.1111 / jth.12852.
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jth.12852/pdf
