зміст .. 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 ..
8.2.
Біотехнологія отримання вторинних метаболітів
Принципи отримання вторинних метаболітів засновані на особливостях їх утворення клітинами мікроорганізмів. У фазі уповільнення зростання і в стаціонарній фазі деякі мікроорганізми синтезують речовини, що не утворюються в логарифмічною фазі і не грають явної ролі в метаболізмі. Ці речовини називають вторинними метаболітами. Їх синтезують не всі мікроорганізми, а в основному нитчасті бактерії, гриби і спороутворюючі бактерії. Серед вторинних метаболітів провідне місце за обсягом виробництва займають антибіотики.
8.2.1. отримання антибіотиків
Антибіотики - специфічні продукти життєдіяльності організмів або їх модифікації, що володіють високою фізіологічною активністю по відношенню до певних груп мікроорганізмів або до злоякісних пухлин, затримуючи їх ріст або повністю пригнічуючи їх розвиток. До антибіотиків відносяться низькомолекулярні ефектори спочатку природного походження, здатні пригнічувати ріст живих клітин.
Антибіотики виникли в боротьбі за існування ґрунтових біоценозів, тому багато хто з них служать засобами нападу і захисту, тобто являють собою своєрідне хімічне «зброю» клітини. Однак ці функції у антибіотиків не єдині. Відомо, що вони можуть брати участь в процесах детоксикації шкідливих метаболітів, контролювати деякі сторони обміну речовин і цілі процеси розвитку, наприклад, диференціювання клітин, служити запасними поживними речовинами. У процесі освіти антибіотиків задіяна значна кількість генів. Масова розшифровка первинної структури геномів мікроорганізмів показала, що ця величина дорівнює 1 - 2%. Так, у Bacillus subtilis число таких генів досягає 2%, що забезпечує мікроорганізму великі можливості для захисту і адаптації. З іншого боку, ця обставина ускладнює аналіз шляхів біосинтезу антибіотиків та ідентифікацію окремих мутацій, здатних збільшити вихід продукту.
Здатність нитчастих гриба зеленої цвілі Penicillium notatum викликати загибель мікроорганізмів вперше була встановлена в 1928 г. англійським мікробіологом А. Флеммінгом. Однак лікувальні властивості цієї цвілі були описані ще в 1871 г. російським дерматологом А. Г. Полотебнова. Відкриття антибіотиків зробило переворот в лікуванні інфекційних захворювань. Пішли в минуле уявлення про невиліковність багатьох бактеріальних інфекцій (туберкульоз, сепсис, сифіліс та ін.). Антибіотики застосовують в ряді галузей народного господарства (рослинництво, тваринництво, ветеринарія, харчова промисловість та ін.), Де вони використовуються більш широко, ніж в медицині, наприклад, для лікування сільськогосподарських тварин, боротьби з фітопатогенними мікроорганізмами, а також для збільшення біомаси тварин ( биомицин - похідне тетрацикліну). Антибіотики широко використовують в якості молекулярних інструментів при дослідженні фундаментальних проблем біології, таких, як розшифровка механізмів біосинтезу білка, нуклеїнових кислот і структури клітинних стінок бактерій, створення моделей транспорту іонів через біологічні мембрани і ін.
Кількість відкритих антибіотиків стає дедалі більше. В 1940 р. було відомо всього 6 антибіотиків, а в даний час описано понад 12 000 аналогічних з'єднань, з яких в клініці застосовують близько 200 препаратів. 97% відомих антибіотиків токсичні, тому в практиці не використовуються.
Дослідження нових форм антибіотиків обумовлено як потребами практики, так і накопиченням резистентних форм мікроорганізмів по відношенню до багатьох антибіотиків. Стійкість бактерій до пеніцилінів і цефалоспоринів створює присутній в їх клітинах ензим лактамаза (пеніциліназа). Фермент гидролизует амидную зв'язок β-лактамних циклу в молекулі антибіотика з утворенням пенициллиновой кислоти, яка повністю позбавлена антимікробної активності:
Пеніцилін пеніцилінових кислота
Резистентність мікроорганізмів до антибіотиків забезпечується різноманітністю фенотипів резистентності і різноманітністю і стабільністю систем горизонтального генного транспорту. Тому головний напрямок отримання нових антибіотиків не у відкритті нових з'єднань, а в хімічній трансформації природних молекул для створення напівсинтетичних антибіотиків, що характеризуються значно меншою резистентністю і токсичністю, але більш широким спектром дії, великим часом життя, хімічної і біологічної стійкістю. Важливий підхід на шляху отримання стійких аналогів антибіотиків - використання природних інгібіторів β-лактамаз - клавулановой і олівановой кислот.
Класифікація антибіотиків. За типом дії антибіотики поділяють на бактерицидні (лактамні, аміноглікозиди), що викликають загибель мікроорганізмів, і бактеріостатичні (макроліди, тетрациклін, левоміцетин), що порушують здатність мікроорганізмів ділитися.
За спектром дії розрізняють антибіотики вузького і широкого дії. До останніх відносять тетрациклін, макроліди, аміноглікозиди, які особливо корисні в разі неідентифікованих збудників хвороби, однак при тривалому застосуванні вони викликають у пацієнтів дисбактеріоз.
Особливість молекулярного механізму дії антибіотиків - виняткова специфічність їх дії. Специфіка дії їх полягає у виборчому придушенні цими ефекторами одного або декількох процесів у деяких мікроорганізмів. Таким чином, антибіотики блокують метаболічні мішені в клітинах-мішенях.
Залежно від специфіки дії антибіотиків на молекулярному рівні розрізняють такі групи сполук:
1. антибіотики, що інгібують синтез клітинної стінки (пеніциліни, ванкоміцин, цефалоспорини, D -ціклосерін);
2. антибіотики, які порушують функції мембран (альбоміцін, аскозін, граміцидини, кандіцідіни, ністатин, тріхоміцін, ендоміцін і ін.);
3. а нтібіотікі, що вибірково пригнічують синтез (обмін) нуклеїнових кислот:
а) РНК (актиноміцин, гризеофульвін, канаміцин, неомнцін, новобиоцин, олівоміцин і ін.);
б) ДНК (актідіон, мітоміцином, новобиоцин, саркоміцін і ін.);
4. антибіотики - інгібітори синтезу пуринів і піримідинів (азасерін, саркоміцін і ін.);
5. антибіотики, що пригнічують синтез білка (канаміцин, метіміцін, неоміцин, тетрациклін, хлорамфенікол, еритроміцин та ін.);
6. антибіотики - інгібітори дихання (олігоміціни, піоціанін, усніновая кислота та ін.);
7. антибіотики - інгібітори окисного фосфорилювання (валиномицин, граміцидини, коліціни, олігоміцін, Тироцидин і ін.);
8. антибіотики, що володіють антіметаболітнимі властивостями, тобто виступають в якості антиметаболітів амінокислот, вітамінів, нуклеїнових кислот (фураноміцін - антиметаболит лейцину);
9. антибіотики-імуномодулятори (Актіноміцини С і D, олівоміцин, рубомицин).
Залежно від хімічної природи і ряду інших властивостей відомі антибіотики ділять на наступні класи:
· Β-лактамних складають більше 50% ринку антибіотиків і відносяться до азотовмісних гетероциклічних з'єднань. У цю групу входить велика кількість антибіотиків, молекули яких містять різноманітні, часто дуже складні кільчасті системи (рис 8.4). Характерна особливість будови β-лактами - наявність в молекулі β -Лактамних кільця (пеніциліни, цефалоспорини):
Ріс.8.4.Структура пеніциліну. Ядро молекули - 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК) - гетероциклічна сполука, що складається з 4-членного β-лактамних (А) і 5-членного тиазолидинового (В) кілець.
· Тетрацикліни входять в групу гетероциклічних сполук (Рис.8.5.) і мають широкий спектр дії (тетрациклін, морфоциклин, метациклин).
Ріс.8.5.Структура тетрацикліну. Тетрациклін: R1 = H; R2 = H; Хлортетрациклин: R1 = H; R2 = Cl; Окситетрациклін: R1 = OH; R2 = H.
· Макроліди. Характерна особливість антибіотиків цієї групи -
Ріс.8.6. Структура еритроміцин а
присутність в молекулі макроциклічними лактонного кільця, пов'язаного з одним або декількома вуглеводними залишками (рис. 8.6). До антібнотнкам-макролідів відносяться метіміцін, еритроміцин, магнаміцін, олеандоміцин та ін.
· Аміноглікозиди - група антибіотиків, загальним в хімічному будову яких є наявність в молекулі аміноцукри, сполученого глікозидної зв'язком з аміноцікліческім кільцем (рис 8.7).
Ріс.8.7. Структура стрептоміцину А
Основне клінічне значення аміноглікозидів полягає в їх активності щодо аеробних грамнегативних бактерій До них належать стрептоміцини, канаміцин неоміцин, гентаміцин, тобраміцин, нетилмицин, сизомицин, амікацин.
· Антибіотики-поліпептиди. Серед вивчених в хімічному відношенні антибіотиків цієї групи найбільш поширені ціклопептіди, що складаються із залишків L - і D-амінокислот. До них відносяться антибіотики, утворені бактеріями (Тироцидин, граміцидини, Бацитрацин, поліміксини, низини, бацілломіціни і ін.) І актиноміцетами (етаміцін, ехіноміціни і ін.)
· Амфеніколи. З'єднання, що відносяться до цієї групи, є похідними бензолу (р іс.8.8). До них відносяться галловая кислота, хлорамфенікол, левоміцетин та ін.
Ріс.8.8. Структура хлорамфеніколу і левоміцетину
· Антибіотики-олігоміціни. К. цієї групи належать сполуки,
Ріс.8.9. Часткова структура олігоміцінов
містять в молекулі пов'язану дієнового систему. За хімічною будовою ці сполуки відносяться до макролактонного (р іс.8.9). Як приклад можна назвати олігоміціни А, В і С, ботріміцін і ін.
· Поліеновие антибіотики, характерна особливість яких - наявність системи, що містить від трьох до восьми пов'язаних подвійних зв'язків, - (СН = СН) - (р іс.8.10). Багато антибіотики цієї групи містять аміноцукор (мікозамін, перозамін), окремі речовини в структурі мають другу Азотомісткі частина - а роматіческіе кетони. До числа полієнових антибіотиків відноситься велике число (більше 150) речовин (мікротріен, ареноміцін, ністатин, фумагиллин, леворин).
Ріс.8.10. структура нистатина
· Антибіотики-хінони. До групи входять бензохінони (рапанон, фумігатін і ін.), Нафтохінони (плюмбагин, яваніцін і ін.) І антрахінони (ендокроцін і ін.). До групи антибіотиків-хинонов відносяться антрацикліни, що налічують близько 70 найменувань. Багато з цих антибіотиків, утворених стрептомицетами, мають протіобактеріальной активністю, а частина з них і протипухлинну дію. До останніх відносяться дауноміцин, адриамицин (доксорубіцин) і до арміпомнцік (рис. 8.11).
а
б
в
Ріс.8.11. Структура хинонами антибіотиків:
а) дауноміцин; б) фумігатін; в) плюмбагин
· Антибіотики-депсіпептіди. Характерна особливість цих антибіотиків (валиномицин, амідоміцін і ін.) Полягає в тому, що вони побудовані із залишків α-окси- і α-амінокислот, з'єднаних між собою складноефірних і амідних зв'язками (рис 8.12).
Ріс.8.12. структура амідоміціна
Залежно від біологічного походження антибіотики поділяють на:
· Антибіотики, що виробляються мікроорганізмами, що відносяться до еубактеріям: піоціанін - Pseudomonas aeruginosa, віскозин - Ps. viscose, діпломіцін, низин - Lactococcus lactis, продігіозін - Serratia marcescens, коліформін - Escherichia coli, протаптіни - Proteus vulgaris, граміцидини - Bacillus brevis, субтілін - В. subtilis, поліміксини - В. polymyxa;
· Антибіотики, що утворюються мікроорганізмами, які належать до порядку Actinomycetales:
а) утворені представниками роду Streptomyces: стрептоміцин - S. griseus, тетрациклін - S. aureofaciens, Str. rimosus, новобиоцин - S. spheroides, еритроміцин - Saccharopolyspora erythraea, Актіноміцини - S. antibioticus і ін .;
б) утворені представниками роду Nocardia: рифаміцин - N. mediterranei, ристомицин - N. fructiferi і ін .;
в) утворені родом Actinomadura: карміноміцін - A. carminata і ін .;
г) які продукують родом Micromonospora: фортіміціни - М. olivoasterospora, гентаміцин - М. ри r ри r еа;
· Антибіотики, утворені ціанобактеріями: малінголід - Lyngbya majuscula;
· Антибіотики, утворені недосконалими грибами: пеніцилін - Penicillium chrysogenum, гризеофульвін - P. griseofulvum, трихотецин - Trichotecium roseum;
· Антибіотики, утворені грибами, що відносяться до класів базидіоміцетів і аскомицетов: термофіллін - базидіоміцети Lenzites thermophila, лензітін - Lenzites sepiaria, хетомін - Chaetomium cochloides (аськоміцетов);
· Антибіотики, утворені лишайниками, водоростями і нижчими рослинами: усніновая кислота (Бінан) - лишайником Usneaflorida, хлореллін - водорістю Chlorella vulgaris;
· Антибіотики, утворені вищими рослинами: аллицин - Allium sativum, рафанін - Raphanus sativum, сатівін - часник, Томатина - томати, Аліна - цибуля, фітоалексини: пізатін в горосі (Pisum sativus), фазеоліна в квасолі (Phaseolus vulgaris);
· Антибіотики тваринного походження: лізоцим, екмолін, круцина, інтерферон.
Методи отримання антибіотиків. Методи отримання антибіотиків шляхом хімічного синтезу надзвичайно складні і не можуть конкурувати з їх біосинтезу методами біотехнології.
Існує кілька способів отримання як природних, так і напівсинтетичних антибіотиків:
· Спрямований біосинтез антибіотиків здійснюваний шляхом прямої ферментації мікроорганізму продуцента з відповідним попередником, що індукує синтез ферментів вторинного метаболізму в ідіофазе. Наприклад, виробництво пеніциліну в значній мірі стимулюється добавками його метаболічного попередника - фенілоцтової кислоти; пропіонова кислота і пропіловий спирт ініціюють біосинтез макролідів через метілмалонілКоА; L-фенілаланін - прискорює утворення граміцидину S.
· Використання інгібіторів метаболізму. Так, при придушенні процесу введення хлору мікроорганізм S. а ureo faciens утворює тетрациклін, а не хлортетрациклин, при інгібуванні реакції метилування їм синтезується деметильоване похідне хлортетрациклина.
· Використання для біосинтезу антибіотиків блокованих мутантів, у яких відсутній (блоковано) певну ланку в ланцюзі реакцій, що ведуть до синтезу антибіотика. Блоковані мутанти не здатні утворювати потрібний антибіотик. Використовуючи низьку субстратне специфічність ферментів вторинного метаболізму і вводячи аналоги попередників антибіотика, останні переводять в аналоги самого антибіотика в ході процесу, відомого як мутаційний біосинтез, або мутасінтез:
а) передбачувана послідовність реакцій, що веде до синтезу антибіотика: А → B фермент → C → D → E → антибіотик
б) відсутність синтезу антибіотика у «блокованого мутанта»:
А → В фермент → C → D
в) синтез модифікованого антибіотика після введення аналога попередника (D *): D * → E * → модифікований антибіотик
Принципи виробництва напівсинтетичних пеніцилінів. Отримання нових більш ефективних аналогів пеніциліну засноване на зміні природи його ацильної угруповання при збереженні в незмінному вигляді ядра пеніциліну - 6-аминопенициллановой кислоти (6-АПК). У промисловості 6-АПК отримують шляхом гідролізу природних пеніцилінів за допомогою специфічного ферменту ряду штамів мікроорганізмів - пеніціллінацілаз. Ацілази розрізняють по їх субстратної специфічності. Деякі з ацілаз здатні каталізувати і зворотні реакції - процеси ацилювання аміногрупи 6-АПК з утворенням модифікованого пеніциліну. У багатьох випадках 6-АПК не виділяють з культуральної рідини, наприклад при перетворенні бензилпеніциліну в ампіцилін:
Бензилпенициллин гидролизуют ацілазой мутанта Kluyve ra cit ro phila при рН 7,8 - 8,0 і температурі 40 - 50 ° С. Потім в ферментатор вносять мутант Pseudomonas melanogenum і фенілгліцін. Умови ферментації змінюють таким чином (рН 5,0 - 5,5), щоб ацілаза другого мутантного організму здійснювала синтез ампіциліну:
Заміна ацильного залишку призводить до синтезу інших напівсинтетичних антибіотиків
Технологія промислового отримання антибіотиків. Біосинтез антибіотиків, як і будь-яких інших вторинних метаболітів, зростає в фазі уповільненого зростання клітинної популяції (кінець трофофази) і досягає максимуму в стаціонарній фазі (ідіофазе). В кінці трофофази змінюється ензиматичний статус клітин, з'являються індуктори вторинного метаболізму, що звільняють гени вторинного метаболізму з-під впливу катаболітной репресії. Тому будь-які механізми, які гальмують клітинну проліферацію і активне зростання, стресові ситуації, активують процес утворення антибіотиків.
Процес культивування ідіолітов проходить дві фази (двустепенчатое культивування). На першій фазі відбувається накопичення достатньої кількості біомаси, яка вирощується на середовищі для зростання мікроорганізму. Ця фаза повинна бути швидкою, а живильне середовище дешевої. На другій фазі здійснюються запуск і активний синтез антибіотика. На цій фазі ферментацію ведуть на продуктивної середовищі.
Освіта антибіотиків регулюється умовами культивування мікроорганізмів. Тому оптимізація живильного середовища є головним фактором у підвищенні виходу продукту.
Много антибіотики беруть свой початок від проміжніх з'єднань обміну ПЕРВИННА метаболітів, тому їх Біосинтез регулюється Шляхом ретроінгібірованія. Так, біосинтез пеніциліну культурою гриба Penicillium chrysogenum контролюється за принципом зворотного зв'язку L-лізин. Крім ретроінгібірованія біосинтез багатьох антибіотиків гальмується високими концентраціями своїх же антибіотиків. Слід зазначити, що в процесі еволюції мікроорганізми виробили механізми захисту від дії власних антибіотиків. Ця проблема успішно вирішується в результаті використання іммобілізованих ферментів.
Більшість антибіотиків отримують при глибинної аеробного ферментації періодичної дії в асептичних умовах. Період ферментації триває 7 - 10 діб. Технологія завершальних стадій процесу визначається природою антибіотика, характером виробництва і цілями подальшого використання антибіотиків.
Для медичних цілей технологія виділення та очищення має особливе значення. Зазвичай вона включає складні багатоступінчасті комбінації різних операцій: екстракцію антибіотиків підходящими розчинниками, осадження і перекристаллизацию їх з різних середовищ, фракціонування на іонообмінних смолах, Ліофільні і распилітельную сушку готових препаратів. Антибіотики виділяють або у вигляді порівняно неочищених препаратів (натрієва сіль пеніциліну), або у вигляді високоочищених речовин (прокаїнової сіль пеніциліну), призначених для клінічного використання. Вихід антибіотиків зазвичай становить кілька десятків грамів на 1 л.
Всі антибіотики проходять біологічний і фармакологічний контроль. Біологічний контроль дозволяє визначити стерильність готового препарату. Для цього використовують метод внесення инактивированного антибіотика в стерильну живильне середовище. Фармакологічний контроль включає в себе визначення спектру дії, токсичності (гострої і хронічної), встановлюють максимально переноситься дозу (МПД), дозу, що викликає 50% загибелі тварин (LD 50) і дозу смертельну для всіх тварин (LD 100). Після всебічного вивчення препарату може бути рекомендований до практичного застосування.
Зміст .. 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 ..
