«Резервний» механізм відновлення печінки

Стаття на конкурс «біо / мовляв / текст»: Швидка втомлюваність, втрата апетиту, нудота, пожовтіння шкірних покривів і навіть часті головні болі - всі ці симптоми можуть бути непрямими свідоцтвами патологій печінки. Незважаючи на високу здатність клітин печінки до відновлення, в деяких важких випадках вони просто не справляються з хворобою. Нове дослідження команди вчених з Центру регенеративної медицини в Единбурзі , Массачусетського технологічного інституту і Сколковского інституту науки і технологій показує, як за допомогою блокування основного шляху відновлення клітин печінки вдалося відкрити резервних «ремонтників».

Ця робота зайняла перше місце в номінації «Біомедицина сьогодні і завтра» конкурсу «Біо / мовляв / текст» -2017 .

Генеральний спонсор конкурсу - компанія «Діаем» : Найбільший постачальник обладнання, реагентів та витратних матеріалів для біологічних досліджень і виробництв.

Спонсором призу глядацьких симпатій і партнером номінації «Біомедицина сьогодні і завтра» виступила фірма « Інвітро ».

«Книжковий» спонсор конкурсу - « Альпіна нон-фікшн »

Здатність організмів до регенерації , Тобто відновленню структури і функцій органів, є однією з важливих загадок медицини, яку людина давно намагається розгадати. Спостереження за тваринним світом дозволили сформулювати наступну закономірність: чим простіше влаштовано тварина, тим легше йому відновити втрачені органи. І якщо дощовий черв'як здатний «добудувати» половину власного тіла, а ящірка - відростити новий хвіст, то у людини здатності до регенерації представлені в більш вузькому діапазоні [1] , [2] .

Казкових істот, здатних відростити собі нову голову або хвіст, досить багато. Але і Лернейская гідра (рис. 1), і горгона Медуза, і навіть Змій Горинич мають цілком реального «родича» - тритона. Цей представник хвостатих амфібій вважається одним з найдавніших видів фауни на Землі. Тритони успішно відновлюють не тільки хвіст і лапи, але навіть пошкоджені серце і спинний мозок. Однак амфібії - далеко не єдині істоти, яким доступна функція «саморемонта». Наприклад, рибок даніо реріо використовують не тільки в акваріумістики, але і для вивчення регенерації тканин серця. А першою твариною, завдяки якому з'явився термін «регенерація», став річковий рак. Вивченням відновлення втрачених ніг у раків займався французький вчений Рене Реомюр, який запропонував новий термін ще в 1712 році.

Малюнок 1. «Битва Геракла з Лернейской гідрою» Антоніо дель Поллайоло (1475 г.).

Не дивно, що вченим хочеться зрозуміти, чому ящірка, наприклад, може відновити загублений хвіст, а людина відростити нову руку не може. Вивчення структури і складу тканин відразу після втрати ящіркою хвоста дозволило виявити модель регенерації у рептилій. У період загоєння базальні клітини епідермісу активно діляться, поступово «закриваючи» собою рану. Додаткова агрегація клітин, які діляться на дистальному кінці хребта сприяє розростанню бластеми - скупченню неспеціалізованих клітин. У цей момент запускаються процеси утворення нових кровоносних судин, а слідом - і нових периферичних аксонів. Найбільш пізно в справу вступають новоутворення кісткової тканини і м'язів. Однак точний механізм регенерації хвоста у ящірок не вивчений до кінця. недавнє дослідження Університету штату Арізона і Інституту геномних досліджень дозволило виявити молекули мікро-РНК, що сприяють регенерації м'язів, хрящів і хребта [3] . Можливо, ця робота дозволить розробити методи лікування, засновані на управлінні експресією генів за допомогою мікро-РНК.

Але як йдуть справи з можливостями регенерації на рівні цілих органів у більш високоорганізованих, ніж ящірки, організмів? Ще недавно вчені були впевнені, що ссавці не здатні відновлювати втрачені органи. Але це переконання похитнуло відкриття, зроблене в лабораторії імунолога Еллен Хебер-Кац з дослідного центру в Філадельфії . Там проводили різні експерименти на особливих «пацієнтів» - генетично модифікованих мишах лінії Murphy Roth Large (MRL) . Такі особини відрізнялися від звичайних тим, що у них не працювали Т-клітини імунної системи. Одного разу доктор Хебер-Кац дала своєму лаборанту нескладне завдання: позначити обраних для чергового експерименту мишей, зробивши у них невеликі двохміліметрові отвори у вухах. Через кілька тижнів з'ясувалося, що дірочок в вухах піддослідних немає. Структура кровоносних судин, хрящів, тканин виглядала неушкодженою. Однак лаборант запевнив доктора, що завдання по «мічену» мишей була своєчасно виконана. Після повторення експерименту з вушної раковиною ефект був таким же: вже через чотири тижні на «проколотих» ділянках вух утворилася бластема (рис. 2) [4] . Наступним «досвідченим» об'єктом став хвіст - і знову вдалося продемонструвати часткову регенерацію тканин. Однак відновлювальні здатності MRL мишей не безмежні: наприклад, виростити нову лапку така миша, на жаль, не змогла. Причина полягає в різному розташуванні і кількості кровоносних судин в органах і тканинах тварини. Без припікання миша просто загине від великої втрати крові - задовго до запуску регенераційних процесів. А припікання на місці ампутованою кінцівки виключає появу бластеми.

Малюнок 2. Етапи відновлення тканини вуха у звичайній лабораторної миші (знизу) і трансформованої лінії MRL (зверху).

В результаті серії спостережень за трансгенними мишами вдалося показати, що секрет їхнього успіху - в певному білку. Так, у мишей лінії MRL заблокована експресія гена, що кодує білок р21 (інгібітор циклінзалежної кінази 1А), який регулює процес нормального ділення клітин. Придушення активності цього гена у нормальних мишей показує аналогічну здатність до регенерації пошкоджень [5] . Але проводити подібні маніпуляції слід з великою акуратністю: «відключення» гена р21 може привести до порушення нормального розмноження клітин, що здатне привести до катастрофічного поділу всіх клітин тіла.

А як йдуть справи з регенерацією у людей? Навіть без «виключення» гена, що кодує білок р21, організм людини може відновлювати деякі органи. Наприклад, шкіру, чия регенерує здатність звична для нас так само, як і повітря. Найбільший за площею орган нашого тіла постійно оновлює власну структуру за рахунок змертвіння і відторгнення клітин епідермісу з подальшою заміною їх новими клітинами. Подібним чином відбувається процес відновлення інших епітеліальних тканин - наприклад, слизових оболонок дихальних шляхів, а також шлунка і кишечника. На другому місці в ієрархії регенерують здібностей знаходиться кісткова тканина. Відомо, що переломи досить успішно загоюються протягом певного періоду нерухомості.

А серед внутрішніх органів заслуженим лідером по регенерації є печінку. Легенда про титана Прометея, у якого всього за одну ніч виклювати печінку виростала знову (рис. 3), має в собі раціональне зерно.

Малюнок 3. «Прикутий Прометей». Скульптура Нікола-Себастьяна Адама, 1762 г. (Лувр).

Дійсно, печінку має унікальну властивість відновлюватися до свого початкового обсягу, навіть якщо зруйновано понад 70% печінкової тканини. Подібний процес відбувається за рахунок роботи клітин печінки - гепатоцитів . Ці клітини відіграють ключову роль в модифікації і виведення з організму токсичних речовин. В здоровому органі, не займане патологічними процесами, ці клітини зазвичай знаходяться в стані спокою. Але при необхідності відновлення цілісності органу, наприклад, після часткової резекції (Видалення частини органу), майже всі гепатоцити активуються і приступають до поділу. Причому діляться вони 1-2 рази, а потім знову повертаються в покоїться стан. Це властивість лежить в основі лікування деяких захворювань, наприклад, цирозу печінки або гепатиту, коли пацієнтові пересаджують частина здорової печінки від донора. Однак такі маніпуляції можуть привести до ряду проблем зі здоров'ям, у тому числі розширення вен стравоходу і шлунка, ниркової недостатності і жовтяниці . Більш того, поява в печінці пацієнта швидко діляться клітин донора може привести до виникнення ракового захворювання. Справитися ж своїми силами при прогресуючої хвороби гепатоцити вже не можуть, адже до поділу здатні лише здорові клітини, яких в організмі хворого залишається все менше і менше.

Виходить, що, незважаючи на потужний регенеративний потенціал, відновлювальні здатності печінки мають межа. У випадках, коли патологічний процес заходить занадто далеко, ефект від роботи гепатоцитів виявляється недостатнім. Наприклад, коли здорова печінка уражається в результаті токсичних або вірусних впливів, що провокує розростання сполучної тканини ( фіброз ). Чи існують інші способи відновлення структури цього життєво важливого органу без участі гепатоцитів? На це питання дозволяє відповісти спільне дослідження команди вчених з Единбурзького університету, Массачусетського технологічного інституту і Сколковского інституту науки і технологій [6] .

Для вивчення процесів регенерації печінки використовували трансгенних мишей лінії tdTomato (TdTom). Ця лінія модифікована червоними флуоресцентними білками, що дозволяє візуалізувати клітини печінки [7] . Однак пошук інших «рятувальних» клітин ускладнює те, що гепатоцити в ураженому організмі продовжують працювати. Для ідентифікації "не-гепатоцитів» дослідники використовували технологію нокдауну генів у мишей. Ефект нокдауну полягає в тому, що дозволяє тимчасово знижувати активність конкретних генів, не вносячи зміни в структуру хромосом і послідовність ДНК. Для «виключення» генів, відповідальних за розподіл і міграцію гепатоцитів, створили особливі ліпідні наночастинки з короткими интерферирующими РНК ( siRNA ) [8] , [9] . З їх допомогою вдалося заблокувати експресію необхідних генів.

зниження проліферації гепатоцитів за рахунок «виключення» цікавлять вчених генів проводили на двох моделях. У першому випадку тимчасово блокували ген ITGB1, який кодує β1-интегрин . Друга модель - одночасне блокування β1-інтегринів і стимуляція надлишкової експресії білка р21. Обидві моделі мали подібним ефектом, проте їх механізми відрізнялися: β1-интегрин викликає некроз гепатоцитів, а надлишкова експресія р21 пригнічує їх проліферацію.

Малюнок 4. Регенерація печінки за допомогою клітин жовчних проток (виділені білим кольором).

Подібна «блокада» основних функціональних клітин печінки привела до незвичайного ефекту: при виключенні головного механізму регенерації запускався резервний спосіб за участю клітин жовчних проток. Так, втрата β1-інтегринів і підвищення рівня білка р21 привели до значного збільшення чисельності гепатоцитів, отриманих з холангіоцитів . Ці епітеліальні клітини жовчних проток складають всього 2-3% від загальної популяції, проте подальші спостереження показали, що саме вони здатні «перепрограмувати» і перетворюватися в гепатоцити, тим самим відновлюючи печінку (рис. 4). Більш того, холангіоцитів показали кращу, ніж гепатоцити, здатність до поділу. Раніше виявили, що вони близькі до овальним клітинам печінки - своєрідним «стовбуровим» агентам даного органу [10] .

Для того щоб відстежити регенеративні здатності холангіоцитів, використовували три незалежних шляху:

1. моделювання холестатической хвороби печінки.
2. моделювання метаболічного неалкогольного стеатогепатиту (Запального процесу, пов'язаного з надмірним накопиченням тригліцеридів в печінці).
3. Моделювання фіброзу печінки (розростання сполучної тканини в печінці при пошкодженні гепатоцитів).

Для вивчення регенерації печінки за приводу не-гепатоцитів за всіма трьома шляхами візуалізували окремі ділянки печінки. Виявилося, що за рахунок холангіоцитів відновлюється приблизно 20-30% гепатоцитів, причому малі проліферативні гепатоцити ідентифікували вже з 7 дня, а до 14 дня регенерації їх кількість значно збільшувалася (рис. 4-6).

Малюнок 5. Динаміка відновлення печінкової тканини за допомогою холангіоцитів (на прикладі моделі холестатической хвороби печінки). Зірочками показані некротичні області; стрілками позначені області з клітинним інфільтратом.

Малюнок 6. Клітини печінки миші, трансформованої по гену ITGB1 (14 день регенерації). Візуалізація за допомогою червоних флуоресцентних білків. 1 - стрілками показані інвазивні клітини; 2 - пунктиром обведена область регенеративного вузла.

Виходить, що в печінці існує резервний механізм регенерації: трансформація клітин жовчних проток в функціональні гепатоцити при блокуванні β1-інтегринів. Можливо, в організмі існують і інші гени-мішені, «вимикання» яких стабілізує процеси, пов'язані з розвитком фіброзу і подальшого цирозу печінки. Ученим ще належить розкрити механізми сигналів, які спонукають жовчні клітини запускати процеси «перепрограмування». Однак результати дослідження вже сьогодні відкривають новий напрям клітинної регенеративної медицини: розробку препаратів, що стимулюють холангіоцитів. Можливо, в майбутньому медицина позбудеться від необхідності проводити складні і дорогі операції по пересадці печінки. Замість цього пошириться більш доступна технологія: «включення» сигналів про необхідність регенерації, коли за допомогою найбільш активних холангіоцитів будуть запускатися процеси активного ділення клітин печінки.

1. Лабораторія молекулярних основ ембріогенезу: від гена до ознаки ;
2. Куликова Н. (2016). Мінога допомогла дізнатися, як у людини з'явився мозок . Сайт ИБХ РАН;
3. Elizabeth D. Hutchins, Walter L. Eckalbar, Justin M. Wolter, Marco Mangone, Kenro Kusumi. (2016). Differential expression of conserved and novel microRNAs during tail regeneration in the lizard Anolis carolinensis . BMC Genomics. 17;
4. Ellen Heber-Katz. (1999). The regenerating mouse ear . Seminars in Cell & Developmental Biology. 10, 415-419;
5. K. Bedelbaeva, A. Snyder, D. Gourevitch, L. Clark, X.-M. Zhang, et. al .. (2010). Lack of p21 expression links cell cycle control and appendage regeneration in mice . Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 5845-5850;
6. Alexander Raven, Wei-Yu Lu, Tak Yung Man, Sofia Ferreira-Gonzalez, Eoghan O'Duibhir, et. al .. (2017). Cholangiocytes act as facultative liver stem cells during impaired hepatocyte regeneration . Nature. 547, 350-354;
7. Флуоресцентні репортери і їх молекулярні репортажі ;
8. Roman L. Bogorad, Hao Yin, Anja Zeigerer, Hidenori Nonaka, Vera M. Ruda, et. al .. (2014 року). Nanoparticle-formulated siRNA targeting integrins inhibits hepatocellular carcinoma progression in mice . Nat Comms. 5;
9. Про всі РНК на світлі, великих і малих ;
10. Киясов А.П., Гумерова А.А., Титова М.А (2006). Овальні клітини - передбачувані стовбурові клітини печінки або гепатобластому? Гени і клітини. 2, 55-58.