У типовому експериментів BDL проводили в 40 самців мишей лінії C57BL / 6 дикого типу масою близько 18-20 грам. Цей експеримент був зробити, щоб досліджувати печінки фіброгенез в фазі ініціації (3 і 7 днів), під час прогресування (10, 14 і 20 днів), а при тривалому (30 і 60 днів) 16. У цій моделі, persinusoidal фіброз вже розроблений на 10-й день після операції, в той час як перипортальній фіброз, що постійно збільшується до кінця експерименту був повністю розроблений після 20 днів. У зазначеному експерименті всі тварини, які отримали просту помилкової операції вижили, і тільки два з 40 мишей (5%), які отримували BDL розроблені поганий загальний стан, і тому вони передчасно вбивали перед кінцевої точки експерименту. Діяльність ложнооперірованних тварин було без винятку вже нормально на наступний день після лапаротомії, а більшість тварин, підданих BDL показали зниження активності протягом перших трьох днів. Jaundiced шкіра була вже очевидна у всіх BDL тварин одного або двох днів після установки в BDL 16.
Значення обох аланінамінотрансферази (АЛТ) і аспартаттрансаміназу (AST), які представляють добре зарекомендували себе в сироватці крові маркерів пошкодження печінки швидко збільшується і досяг в період з 7 дня і 20 днів після BDL (таблиця 1). Після цього, АЛТ і АСТ не завжди знижується до 30 дня і залишалася стабільною до 60 днів після операції. Відповідно до холестатической травми, концентрації в сироватці крові загального білірубіну були постійно збільшені і досягли плато після 7 днів 16. Аналогічна час курс АЛТ і АСТ в сироватці крові діяльності були також зареєстровані у щурів, які зазнали BDL. У недавньому дослідженні було продемонструвати, що сироватка АСТ і АЛТ, виріс до 5 або 10 разів від норми на першому тижні після операції BDL і зменшується після двох тижнів 19.
Як правило, печінку ложнооперірованних тварин як і раніше виглядають Смутч в кінці експерименту, в той час як печінка тварин, які отримували BDL показати архітектурні зміни, які в основному характеризується утворенням набряку і фіброзних вузликів на поверхні відповідних печінку і водянка жовчного міхура, який заповнюється з великою кількістю жовч (Малюнок 7). Характерні морфологічні зміни печінки, індуковані операції BDL також доказовою в стандартному гістологічного аналізу (рисунок 8).
У той же серії експериментів, розвиток фіброзу печінки була напів-кількісно оцінюється на основі гістології печінки оцінювали сліпим патологоанатомом з використанням системи балів, в якій перипортальній фіброз був поставлений з 0-4 і перісінусоідальним фіброзу від 0-2, даючи максимум Значення, яке було еквівалентно цирозу 6. Як і очікувалося, фіброзі середнє в групі ложнооперірованних тварин було 0,00 ± 0,00. На противагу цьому, в групі тварин, тшлем, отримані BDL, оцінка не постійно збільшується до 60 діб до значення 4,83 ± 0,17. Максимум 3 для перипортальной фіброзу була досягнута на 20-й день у всіх аналізованих тварин, перісінусоідальним фіброз відсутній протягом перших 10 днів експерименту і був помітний по-перше, через два тижні. Після цього, він постійно збільшується до кінця експерименту до значень 1,8 ± 0,17 (табл.1).
Крім того, в деяких інших незалежних експериментах на тваринах, які були виконані, було відзначено, що формування фіброзу була високою відтворюваністю, що показує залежить від часу збільшення внутрішньопечінкового експресії колагену і осадження в результаті безперервного фиброгенеза (фіг.9). Аналогічним чином, процес постійної фиброгенеза помітно в підвищеної експресії α-актину гладких м'язів (α-SMA), що представляє собою маркер фібробластів клітин, тобто активоване зірчастих клітин печінки і портальні міофібробласти, і печінки гидроксипролина, амінокислота в достатку знайти в колагенові матриці 18 (фіг.9). Крім того, вираз віментину, що вказує на збільшення кількості міофібробластами або фібробластів збільшується після установки операції BDL 20. Сопутствованіе запалення в пошкоджених печінки додатково відбивається підвищеною експресією Ліпокалін 2 (LCN2), сильно індукованої під час гострої і хронічної травми печінки і розвивається печінково-захисні ефекти під час гострого пошкодження печінки 21,22.
Запальні клітини, які проникають в печінці тварин, які отримували BDL можуть бути виявлені за допомогою специфічного фарбування з використанням антитіла, специфічні для CD45 (рисунок 10). Це стільникового поверхневий маркер, який також відомий як PTPRC (протеїн-тирозин-фосфатази, типу рецептора) специфічно експресується у всіх диференційованих гематопоетичних клітин, за винятком еритроцитів і плазми клітин.
<TD> 14.38 ± 2.14 ± Час після жовчних проток лигирования (днів) Загальний білірубін АСТ (од / л) ALT (U / L) Портальний фіброз перісінусоідальним фіброз Загальний рахунок (Мг / дл) 0 (п = 3) 0,17 ± 0,06 192,67 ± 30,50 50.33 ± 6.03 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 3 (N = 5) 6,85 ± 2,21 1159,25 ± 319,27 566,50 ± 335,25 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 7 (N = 5) 976,60 ± 477,16 448.20 ± 259,47 0,60 ± 0,25 0,0 ± 0,0 0,60 ± 0,25 10 (N = 5) 15.92 ± 2.60 1916,60 ± 868,25 560,40 ± 80,88 1.40 ± 0.25 0,25 ± 0,25 1,67 ± 0,25 14 (N = 5) 17.90 ± 3.84 1088,60 ± 276,32 505.00 ± 96.15 ± 2,4 ± 0,25 1,0 ± 0,0 3.40 ± 0.24 20 ( N = 4) 18.00 ± 2.12 1072,67 ± 364,27 404.00 ± 195,48 3,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 4,0 ± 0,0 30 (N = 5) 16.04 ± 4.79 446.40 ± 169,75 260,20 ± 126,97 2,8 ±; 0,2 1,4 ± 0,25 4.20 ± 0,20 60 (N = 6) 16.02 ± 1.19 484,67 ± 117,79 257,17 ± 50,97 3,0 ± 0,0 1,8 ± 0 , 17 4.83 ± 0.17
Скорочення, що використовуються є: ALT, аланінамінотрансферази; АСТ, аспартатамінотрансферази.
Таблиця 1: фіброз вчинення в типовому експерименті Дані цієї таблиці був відтворений з дослідження, в якому фіброз печінки индуцировали лігуванням жовчних проток в C57BL / 6 мишей 16 .. У цьому дослідженні, смертність після операції BDL було 5% (2 з 40 тварин були достроково в жертву, тому що погані умови для тварин розробці).
Малюнок 1: Експериментальна установка для виконання жовч канал перев'язки. тварина тримали на розігрів пластини при температурі 37 о С і оперативно територія покрита цілому з непроникна для рідини, самоклеючих штори. Повною операції, тварина постійно підключений до системи анестезії. Всі вимірювальні прилади і рішення (анальгетики, анестетики, антисептичний розчин, 0,9% NaCl) розташовані ясно.
Малюнок 2 :. Отримання області хірургії До відкриття черевної порожнини, черевної шкіри повинні бути поголені з електричним хутра бритви і дезінфекції з антисептичним марлевою тампоном. Площа хірургія потім покривається непроникна для рідини, самоклеючих штори. Живіт відкрився серединної лапаротомії (~ 2 см в довжину). Порожнина збільшується, вставивши холдингової шов в грудині і область роботи, распространеннуювставкі втягує Colibri, що дозволяє безперешкодний експериментів під час операції.
Малюнок 3: Вплив жовчної протоки. () Для проведення жовчних проток лигирования, черевна сторона печінки піднімається так, що він може дотримуватися діафрагми і печінки воротах стає чітко видно. (B) краще виставити жовчний протік, кишка каудально переїхав з зволожений ватний тампон. Жовчних проток відзначений стрілкою.
Малюнок 4: лигирования жовчної протоки. (А) В якості першого кроку, жовчних проток, ретельно відокремити від фланкирующей ворітної вени і печінкової артерії за допомогою мікро-насічкою щипців. (В) Надалі шов розміщені вокругжелчних проток і закріплені з хірургічним вузлом. (С) Після другого шва поміщають в безпосередній близькості від першого шва і вузлом навколо жовчної протоки. (D) шовний скорочується, порожнину промивають 0,9% -ним розчином NaCl і всі органи замінені на їх фізіологічному положенні.
Малюнок 5: .. Точне уявлення зав'язування Для документування розміщення швів і установку двох вузлів, які перешкоджають жовчі, сама процедура, описана в малюнку 4 був зареєстрований під бінокулярним () приміщення жовчної протоки з перший шов. (В) Заузліваніе першого шва. (С) Утримання жовчної протоки з другим швом. (D) Заузліваніе другої нитки. (Е) Двічі лігували жовчі DUCT після скорочення надлишкових швів. (Е ') Ця панель зображує ескіз (Е). Позиції права (RL), справа наліво (LL) і середній (мл) часткою печінки, а також жовчних проток, шлунка, дванадцятипалої кишки і позначені літерами. В ескізі жовчних проток двічі лігували двома швами.
Мал. 6: анатомія жовчної протоки, ворітної вени і печінкової артерії у мишей Для кращого анатомічного розташування загальної жовчної протоки, ворітної вени і печінкової артерії зображені у вигляді схеми. Відзначено також позиції правого (RL), ліворуч (LL) Середній (мл) і хвостатого (CL) часткою печінки.
Малюнок 7: Представник appeara сть з печінки через 2 тижні після імітації операції і BDL. C57BL / 6 мишей піддавали симуляції операції або операції BDL. Через два тижні вісцерального порожнини була відкрита. У той час як печінка Тварин з помилковою операцією не показував жодних ознак фіброзу, печінка тварин, які отримували лігування жовчної протоки була нерегулярну структуру поверхні з утворенням набряку і фіброзних вузликів на поверхні відповідних печінки.
Фігура 8 :. Гематоксиліном і еозином пляма зрізів печінки були отримані з C57BL / 6 дикого типу тварин, які були з помилковою операцією (А) або отриманих BDL протягом трьох тижнів (B). Зрізи фарбували гематоксиліном і еозином наступних стандартних процедур. Будь ласка, зверніть увагу на типові зміни в печінці BDL, які включають ознаки запалення (проникають клітини), паренхіматозні (печеночноціт) некроз, і поширення жовчних проток. Бар масштаб в кожній фігурі панелі представляє 50 мкм. Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.
Малюнок 9: гістологічні та біохімічні показники по печінці фиброгенезе. (A) печінки зрізи отримують з тварин, які отримували імітації операції або BDL протягом 2 тижнів і фарбували Sirius Red (верхньої панелі, колагенових волокон в червоний колір), або аналізували на експресію α-актину гладких м'язів (α-SMA) (нижня панель , α-SMA-позитивних клітин в коричневий) за допомогою імуногістохімії. Бар масштаб в кожній фігурі панелі являє 100 мкм. (B) білкових екстрактів з печінки були піддані вестерн-блот і аналізували на expreделенія колагену типу I, α-SMA і Віментин, які добре встановленому маркери печінкового фіброгенезу. Вираз Ліпокалін-2 (LCN2) вказує на запальний відповідь, пов'язаний з постійною фиброгенеза. У цьому аналізі, так само білка навантаження була продемонстрована зондування плями з антитілом, специфічним для β-актину. Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.
Малюнок 10 :. Імунологічні фарбування проникнення запальних клітин Серійні зрізи печінки були отримані з печінки тварини, яка отримала жовчних перев'язки протягом 3 тижнів. Зрізи фарбували гематоксиліном і еозином (А) або з антитілом, яке специфічно для CD45 (B). Будь ласка, зверніть увагу, Велика кількість CD45-позитивних клітин, що оточують жовчні протоки. Ці масові інфільтрати, які вказують запалення не помітні в зрізів печінки, отриманих з Тварин з помилковою операцією (не показаний). Бар масштаб в кожній фігурі панелі являє 500 мкм. Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.
