CL Maunder, ZF Reynolds, L. Peacock, EJ Hall, MJ Day, and TA Cogan
School of Veterinary Sciences, University of Bristol, Langford, UK
Робота в рамках даного дослідження проводилася в Школі ветеринарних наук Брістольського університету (School of Veterinary Sciences, University of Bristol) за підтримки гранту від Ленгфордского Траста (Langford Trust). Матеріал, описаний в даній статті, був представлений на Конгресі Європейського коледжу ветеринарної медицини в Лісабоні (European College of Veterinary Internal Medicine Congress), Португалія, в 2015 році.
скорочення:
12-LOX - 12-ліпоксигенази
AIEC - адгезивні та інвазивні E. coli
ДНК - дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК)
FCEAI - індекс активності хронічної ентеропатії у кішок
FISH - флюоресцентная гібридизація in situ
H & E - гематоксилин- еозин
HPF - поле зору при великому збільшенні
ВЗК - запальне (-і) захворювання (-я) кишечника (ВЗК)
IL-8 - інтерлейкін-8
NF-B - ядерний фактор каппа бета
ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
rRNA - 16S- рибосомальная рибонуклеїнова кислота
WSAVA - Всесвітня ветеринарна асоціація по дрібним тваринам
Запальні захворювання кишечника є частою причиною хронічної симптоматики у кішок з хворобами шлунково-кишкового тракту [1]. Для підтвердження факту запального процесу в кишечнику потрібно проводити біопсію, але найчастіше первинну причину процесу виявити не вдається, і такі випадки зараховують до идиопатическим [1-3]. Для цього типовий лімфоплазмоцітарной характер запалення в зразках біопсії, але у частини кішок, які страждають ВЗК, виявляється нейтрофільні запалення слизової оболонки кишечнику. Причини нейтрофильного запалення не ясні. Воно може виникати внаслідок бактеріальної інфекції, але нейтрофільний коліт виявлявся у кішок з інфекцією Tritrichomonas foetus [4], а також в одному описаному випадку [5], де бактеріальної інфекції знайдено не було. Пухка консистенція і із'язвлённость слизової теж може бути причиною нейтрофильной інфільтрації в зв'язку з втратою цілісності слизового бар'єру. Якщо первинний етіологічний агент не вдається виявити, виникають труднощі з призначенням адекватної терапії; в таких випадках можна вдатися до емпіричної антибактеріальної терапії.
За допомогою традиційних діагностичних технік досить складно знайти першопричину нейтрофильного запалення слизової кишечника. Клінічна релевантний аналізу калу в таких випадках низька, оскільки ті ж бактерії, які виявляються у тварини з діареєю, можна знайти і у здорової тварини [6-9].
Використання флюоресцентной гібридизації in situ (FISH) дає можливість знайти і візуалізувати інтактні бактерії всередині тканин і їх локалізацію, що дає уявлення про етіологію процесу [10]. В гастроентерології дрібних тварин FISH застосовувалася для виявлення Helicobacter spp. в шлунку і контролю ефективності лікування [11], проба дозволила наочно показати, що інвазивний E. coli (AIEC) у боксерів асоціюється з гранулематозним колітом і піддається лікуванню курсом пролонгованих антибіотиків [12, 13], Janeczko [14] за допомогою FISH виявив, що у кішок, які страждають шлунково-кишковими розладами, в слизовій кишечника міститься більше ентеробактерій в порівнянні зі здоровими кішками, хоча не було точно встановлено, є це причиною запалення або наслідком ерозії слизової укупі з дисбактеріозом.
Цілями даного дослідження були:
- Виявити наявність і ідентифікувати інтактні бактерії в препаратах з біопсії за допомогою FISH.
- Визначити локалізацію нейтрофілів і близькість до бактерій, що демонструє асоціацію запалення з інфекційним процесом і можливу бактеріальну етіологію процесу.
матеріали та методи
вивчення популяції
Зразки для вивчення були взяті з архіву University of Bristol, School of Veterinary Sciences. Критеріями включення в дослідження була наявність діагнозу нейтрофильного або лімфоплазмоцітарной запалення в зразках дуоденальної біопсії і їх достатні якість і розмір для проведення FISH як мінімум на трьох ворсинках з збереженій lamina propria до м'язового шару.
Цим критеріям відповідали зразки 15 кішок (7 з нейтрофільним ВЗК і 8 з лімфоплазмоцітарной), які були фіксовані формаліном і парафіном. В історіях хвороби були опису симптомів пацієнтів, але про вираженість симптоматики і реакції на лікування не говорилося. Етичне схвалення для даного дослідження було отримано від University of Bristol Ethics Committee. Зразки всіх кішок були ретроспективно досліджено на предмет наявності кишкових бактеріальних агентів за допомогою ПЛР.
гістологічний аналіз
У кожному разі зразки, пофарбовані гематоксилін-еозином, були досліджені сертифікованим ветеринарним патологоанатомом (MJD) без попереднього ознайомлення з історією хвороби. Гістологічні зміни оцінювалися за шкалою, розробленою WSAVA Gastrointestinal Standardization Group [15]. Оцінці зазнали п'ять ознак запального процесу (інтраепітеліальні лімфоцити, лімфоцити власної пластинки, клітини плазми, еозинофіли і нейтрофіли та інші типи беруть участь в процесі запалення клітин). Також були досліджені деякі морфологічні параметри запалення слизової (недорозвинення ворсинок, пошкодження слизової, дилатація / деформація крипт, фіброз слизової). Морфологічні зміни відзначалися, але значних відмінностей між групами не було. В кінцевому підсумку все діагнози були розділені на 8 груп, в залежності від гістологічної картини: без патології (NAD), лімфоплазмоцітарной запалення, еозинофільні запалення, лімфоангіоектазія, лімфома, атрофія / фіброз слизової (НЕ запального характеру) та інші. У дослідження включалися тільки зразки з лімфоцитарним і нейтрофільним запаленням.
Таблиця 1. Проби FISH олігонуклеотидів. Деталізація послідовності олігонуклеотидів, використовувана для локалізації бактерій in situ в тканинах з дуоденальної біопсії
Флюоресцентная гібридизація in situ - Бактерії
Флюоресцентная гібридизація in situ hybridization (FISH) проводилася на фіксованому в формаліні з посиленням парафіном матеріалі з біопсії з використанням методу, трохи відрізняється від раніше описаного в літературі: буфер гібридизації містив 25% формамід, в порівнянні з 30% формамідом в попередніх дослідженнях [16] .
Використовувалися проби для спрямованих маркерів флюоресценції олігонуклеотидів 16S-рибосомальной рибонуклеїнової кислоти (таблиця 1). Отримані секції з кожної біопсії аналізувалися в кілька кроків, кожен з яких складався з різних комбінацій проб. Кроки № 1 і № 2 складалися з проб на Еубактеріі і Фірмікути по три проби для кожної групи бактерій. Комбінації проб з невеликими варіаціями в їх проведенні використовувалися, щоб максимально розширити спектр кожної комбінації. Група № 3 складалася зі специфічних проб на Кампілобаріі: перша проба на C. upsaliensis, друга на C. jejuni, остання - на все термофільні Кампілобактерії. Ті бактерії, які виявлялися тільки в останній пробі, могли виявитися або C. lari, або C. coli, і в подальшому піддавалися аналізу з допомогою ПЛР. Ми не проводили окремого тесту на специфічні типи C. coli і за допомогою даної методики не могли виявити AIEC.
Оброблені слайди були поміщені на скло, оброблені розчином Vectashield з барвником DAPI. Приготовлені скла були розглянуті мікроскопом Leica DMR-A з монохромного цифровою камерою Hamamatsu 8-bit. Бактеріальні клітини підраховувалися в епітелії і власній пластинці під 400-кратним збільшенням «сліпим» (чи не посвяченим у суть дослідження з метою збереження об'єктивності) дослідником на 10 полях зору, в результаті в розрахунок було взято середнє арифметичне кількість. Поля зору вибиралися таким чином, щоб вони знаходилися ближче до центру препарату, містили епітелій і не перекривали один одного.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
ДНК витягалася за допомогою набору DNeasy ™ для крові тканин (Qiagen, Manchester, UK). Далі вони проходили скринінг в by Langford Veterinary Services (Bristol, UK) на Сальмонели, патогенні E. coli, Кампілобактерії і Клостридії. Фрагмент 153-bp ДНК, унікальний для кампілобактерій, посилювався за допомогою ПЛР [17] і секвенований для підтвердження відповідності кампілобактер.
Флюоресцентная гібридизація in situ - близька локалізація бактерій і нейтрофілів
Проби на C. jejuni і термофільні Campylobacter spp. використовувалися в комбінації з реакцією FISH для виявлення нейтрофильной еластази мРНК кішок. Проба на нейтрофільних еластазу 5'CAGAGGCTGCTGAACGACATCGTGATTCTCCAGCTCAAT3 '; проводилась одночасно з пробами для кампілобактерій (термофільний Campylobacter spp. 5'GCCCTAAGCGTCCTTCCA 3; і C. jejuni 5 '; AGCTAACCACACCTTATACCG 3').
Слайди розглядалися з флюоресцентной підсвічуванням на мікроскопі DMRB (Leica), укомплектованому камерою Retiga EXi (QImaging) з програмним забезпеченням для візуалізації Volocity (PerkinElmer) на предмет прояви нейтрофильной еластази кішок і кампілобактер. Знімок проводився, коли в поле зору (збільшення × 400) було видно експрессор нейтрофильной еластази і один або обидва експрессора кампілобактер. Також проводився запис про будь-якому експрессоре нейтрофильной еластази, коли в поле зору не було ні експрессоров Камбілобактерій, ні слідів присутності C. jejuni або термофільних кампілобактер. Знімки були оброблені за допомогою сервісу Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij), щоб автоматично виміряти дистанцію між точками, обраними користувачем - нейтрофілами і кампілобактер. Відстань вимірювалося в пікселях на цифрових знімках. Максимальним розміром поля було вибрано 1850 пікселів. Використання цього сервісу дозволило зробити безліч точних вимірювань, необхідних для статистичного аналізу.
Статистика
Аналіз проводився за допомогою спеціального програмного забезпечення - GraphPad Prism version 5.03. Присутність бактерій у кішок з нейтрофільним і лімфоплазмоцітарной ВЗК порівнювався і перевірялося на статистичну значущість за критерієм хі-квадрата.
Відмінності між групою з нейтрофільним запаленням і групою з лімфоплазмоцітарной запаленням в кількості бактерій різних видів, знайдених в тканинах, аналізувалися по U-критерієм Манна-Уїтні. За тим же принципом аналізувалася різниця в дистанції між C. jejuni і нейтрофілами і C. coli і нейтрофілами.
результати
15 кішок (11 котів і 4 кішки) підійшли за критеріями: вісім з них були домашніми короткошерстих (DSH), одна - домашній довгошерстою (DLH), і п'ять кішок були чистокровними (мейн-кун, дві сіамських, бірманська, орієнтальна). У одного із зразків біопсії порода була не вказана. Вік кішок був від 2 до 15 років (в середньому 9). Дослідження бактеріальної ДНК показало, що ні у кого з кішок не було сальмонели або патогенних генотипів E. coli (як було сказано раніше, не можна при цьому виключати наявність AIEC). Одну тварину в кожній групі (нейтрофільні і лімфоплазмацітарное запалення) мало позитивні результати на наявність клостридії. Всі тварини мали позитивний результат на наявність кампілобактерій. Секвенування послідовностей на предмет ідентифікації кампілобактер виявило, що знайти C. lari і C. Upsaliensis не вдається. У тканинах присутні тільки види C. coli і C. jejuni. Результати аналізів за допомогою ПЛР та FISH збігалися (илл. 1).
Наявність бактерій у кішок з нейтрофільним ВЗК і у кішок з лімфоплазмоцітарной ВЗК
Бактерії були знайдені і у кішок з нейтрофільним запаленням, і у кішок з лімфоплазмоцітарной запаленням. Значної різниці в кількості еубактеріямі, знайдених в обох групах, не спостерігалося. Було знайдено лише незначна кількість C. upsaliensis, і подальший статистичний аналіз проводити не було сенсу. C. jejuni і C. coli виявилися в більшій кількості, тому їх розподіл між групами було проаналізовано. Значної різниці в кількості C. jejuni в слизовій між групами не було. Однак C. coli в більшій кількості присутній у кішок з нейтрофільним запаленням (6/7), чим у кішок з лімфоплазмоцітарной (1/8), і різниця виявилася значною (P = 0,009) (илл. 1).
Кількість бактерій у кішок з нейтрофільним ВЗК і у кішок з лімфоплазмоцітарной ВЗК
Порівнювався кількість C. jejuni і C. coli в слизової у кішок з нейтрофільним запаленням і у кішок з лімфоплазмоцітарной запаленням. Для C. jejuni цифри були приблизно рівні в обох групах, і значної різниці в розподілі не спостерігалося. Для C. coli значення виявилися більшими у кішок з нейтрофільним запаленням (середня кількість бактерій в поле високого збільшення (× 400) склало 0,7), в порівнянні з кішками з лімфоплазмоцітарной запаленням середня кількість бактерій в поле високого збільшення (× 400) склало 0 ), і різниця була значною (P = 0,002) (илл. 1).
Локалізація бактерій і нейтрофілів
У слизовій кішок з лімфоплазмоцітарной запаленням кількість нейтрофілів було невеликим, щоб оцінити їх сусідство з бактеріями - на 62 з 63 полях зору не вдалося знайти нейтрофілів і кампілобактер в межах одного поля зору. У слизовій кішок з нейтрофільним запаленням такий результат був тільки на 6 з 63 полів. Клітини експресії нейтрофильной еластази мали звичайну Поліморфноядерні структуру на світловому мікроскопі.
У слизовій кішок з нейтрофільним запаленням було проаналізовано сусідство C. jejuni і C. Coli; кількість C. Upsaliensis було недостатньо для аналізу. Для C. jejuni не було виявлено жодної очевидної зв'язку в локалізації бактерій і нейтрофілів, і часто вони не виявлялися в одному і тому ж полі зору разом (> 1850 пікселів). Для C. coli такий зв'язок простежувалася - P <0,001 (илл. 2).
Обговорення
Запальне розлад кишечника - одна з причин хронічних симптомів шлунково-кишкових захворювань у кішок, поряд з негативною реакцією на їжу, ентеропатію при антибіотикотерапії і інфекцією (віруси, гриби, бактерії, найпростіші, паразити). Випадки з гістологічними змінами в результаті нейтрофильного запалення можуть виникати внаслідок інвазії мікроорганізмів, бути вторинними після пошкодження слизової або інфекції Tritrichomonas foetus, або бути идиопатическими. Метою даного дослідження було за допомогою FISH з'ясувати, присутній інвазія мікроорганізмів у слизовій кишечника при котячому ВЗК, і виявити будь-який зв'язок між інвазією кампілобактер і нейтрофільним запаленням (фото 1).
Бактерії виявлялися у кішок з обома типами запалення, бо свідчить про збільшення проникності слизової. У їх розподілі по тканинах не було будь-якої закономірності (слизова, підслизова, власна пластинка). Загальна кількість бактерій було приблизно однакове в обох групах, і для двох видів (C. jejuni і C. upsaliensis) між групами не було виявлено значної різниці в розподілі. Значна різниця була відзначена в розподілі бактерій C. coli. Само по собі це тільки спостереження, і воно лише демонструє, що у кішок з нейтрофільним запаленням присутні більше C. coli. Проте спроби FISH демонструють близьку прихильність до нейтрофілів і їх можливу асоціацію з C. coli. Зв'язки між локалізацією нейтрофілів і інших бактерій нам виявити не вдалося. Цей зв'язок доводить, що є часткова асоціація інфекції C. coli зі специфічним нейтрофільним запаленням в слизовій дванадцятипалої кишки у кішок з ентеритом в порівнянні з іншими мікроорганізмами.
Рід Campylobacter відомий своїм властивістю сильної хемоаттракціі для нейтрофілів. Попередні дослідження in vitro на клітинах свинячого і людського епітелію показали, що C. jejuni і C. coli запускають нейтрофільні запалення слизової через активацію ядерного фактора «каппа-бі» (NF-B) і подальшу продукцію нейтрофильного ІЛ-8, а також викликають міграцію нейтрофілів крізь епітелій через продукцію хемотаксичних n-formyl пептидів і метаболітів 12-ліпоксигенази [18, 19]. В даному ретроспективному дослідженні були отримані дані про те, що C. coli, але не C. jejuni виявляються близькі по локалізації з нейтрофілами і, отже, можуть бути етіологічним агентом в цьому конкретному варіанті ВЗК, хоча в процес також можуть бути залучені і інші клітини і механізми. У дослідженнях in vitro з котячими нейтрофилами так само, як і в попередніх дослідженнях з нейтрофілами свиней [18, 19], необхідно виявляти механізм хемоаттракціі.
Обмеження дослідження в основному пов'язані з його ретроспективним аналізом і браком вихідних клінічних даних. Крім того, під критерії включення підійшло так мало зразків, оскільки багато інших не задовольняли якістю та кількістю необхідного матеріалу.
Ми не змоглі задокументуваті Відмінності в клінічному прояві в двох групах або отріматі доступ до Даних, пов'язаних з лікуванням та результатом, оскількі НЕ всі ЦІ тварини проходили повний курс лікування безпосередно в нашому госпіталі; зразки були взяті з нашого архіву, и наші цілі звелено до Виявлення зв'язку между бактеріямі и захворюванням. Шлюб клінічніх Даних такоже означає, что нам невідомо, чи брали досліджувані тварини антибіотики перед проведенням біопсії. Цей фактор может сильно вплінуті на результат, проте Попередній прийом антібіотіків очевидно сильно знизу бі загальна Кількість бактерій, а отже, и ймовірність Побачити значний різніцю между групами в їх розподілі, если віключіті ймовірність того, что всі кішкі з лімфоплазмоцітарной запаленою отримувалася антібіотікотерапію, а все кішкі з нейтрофільнім - немає. Крім того, аналіз калу міг виявитися дуже корисний у виявленні Campylobacter spp. Наступні за цією працею дослідження повинні оцінити клінічні та терапевтичні чинники.
Гістологічна класифікація і подальший аналіз виконувалися на зразках з біопсії і можуть не відображати природу запальних змін в інших відділах шлунково-кишкового тракту. Попереднє дослідження [20] на собаках з ентеропатію показало, що зміни слизової дванадцятипалої кишки і клубової кишки можуть сильно гістологічно відрізнятися. Інше дослідження [21] так само продемонструвало слабкий зв'язок між гістологічними картинами з біопсій з клубової та дванадцятипалої кишки; але, незважаючи на ці відмінності, лімфоплазмоцітарной запалення набагато менше відрізняється від Мікроклітинна лімфоми, ніж від нейтрофильного запалення. Хоча й існує ймовірність, що запальні зміни в інших ділянках шлунково-кишкового тракту будуть відрізнятися від зразків з дванадцятипалої кишки, наша гіпотеза пов'язана з інфекційною етіологією локалізованого нейтрофильного запалення, так що наші знахідки залишаються достовірними.
Попередні висновки з даного дослідження підкреслюють необхідність продовження вивчень даного питання з метою виявити зв'язок локалізації C. coli в тканинах з характером запалення. Це дозволити зрозуміти, чи відрізняється у таких кішок клінічні прояви і оцінка за шкалою FCEAI і їх ендоскопічна картина. Виявлення C. coli як етіологічного фактора дозволить точніше підбирати тактику лікування і потенційно поліпшить клінічний прогноз і знизить зоонозних ризик [8, 22]. Подальші молекулярні дослідження in vitro допоможуть зрозуміти, яким чином C. coli індукує нейтрофільний відповідь: чи виробляє він сполуки, що стимулюють нейтрофіли, або ж змушує клітини кишечника кішки виробляти нейтрофільні хемоаттрактанти. Крім того, дослідження в цій області можуть виявити фактори ризику для господарів цих тварин.
література
1. Hall EJ, German AJ. Diseases of the small intestine. In: Ettinger SJ, Feldman EC, eds. Textbook of Veterinary Internal Medicine, 7th ed. St.Louis, MO: Elsevier Saunders; 2010: Додати 1526-1572.
2. Washabau RJ, Day MJ, Willard MD, et al. Endoscopic, biopsy, and histopathological guidelines for the evaluation of gastrointestinal inflammation in companion animals. J Vet Intern Med 2010 року; 24: 10-26.
3. Willard MD. Feline inflammatory bowel disease: A review. J Feline Med Surg 1999; 1: 155-164.
4. Yaegar MJ, Gookin JL. Histologic features associated with Tritrichomonas foetus-induced colitis in domestic cats. Vet Pathol 2005; 42: 797-804.
5. Leib MS, Sponenberg DP, Wilcke JR, et al. Suppurative colitis in a cat. J Am Vet Med Assoc 1986; 188: 739-741.
6. Acke E, Whyte P, Jones BR, et al. Prevalence of thermophilic Campylobacter species in cats and dogs in two animal shelters in Ireland. Vet Rec 2006; 158: 51-54.
7. Hill SL, Cheney JM, Taton-Allen GF, et al. Prevalence of enteric zoonotic organisms in cats. J Am Vet Med Assoc 2000; 216: 687-692.
8. Marks SL, Rankin SC, Byrne BA, et al. Enteropathogenic bacteria in dogs and cats: Diagnosis, epidemiology, treatment and control. ACVIM Consensus statement. J Vet Intern Med 2011 року; 25: 1195-1208.
9. Rossi M, Hänninen ML, Revez J, et al. Occurrence and species level diagnostics of Campylobacter spp., Enteric Helicobacter spp. and Anaerobiospirillum spp. in healthy and diarrheic dogs and cats. Vet Microbiol 2008; 129: 304-314.
10. Simpson KW. Bacteria and inflammatory bowel disease: causes and consequences. Proceedings of the 33rd World Small Animal Veterinary Association Congress Dublin, Ireland 2008. Available at: http://www.vin.com/members/cms/project/defaultadv1.aspx?pId=11268&meta=VIN&catId=32729&id=3866515. Accessed April 15, 2015.
11. Jergens A, Pressel M, Crandell J, et al. Fluorescence in situ hybridization confirms clearance of visible Helicobacter spp. associated with gastritis in dogs and cats. J Vet Intern Med 2009 року; 23: 16-23.
12. Simpson KW, Dogan B, Rishniw M, et al. Adherent and invasive Escherichia coli is associated with granulomatous colitis in boxer dogs. Infect Immun 2006; 74: 4778-4792.
13. Mansfield CS, James FE, Craven M, et al. Remission of histiocytic ulcerative colitis in Boxer dogs correlates with eradication of invasive intramucosal Escherichia coli. J Vet Intern Med 2009 року; 23: 964-969.
14. Janeczko S, Atwater D, Bogel E, et al. The relationship of mucosal bacteria to duodenal histopathology, cytokine mRNA and clinical disease activity in cats with inflammatory bowel disease. Vet Microbiol 2008; 128: 178-193.
15. Day MJ, Bilzer T, Mansell J, et al. Histopathological standards for the diagnosis of gastrointestinal inflammation in endoscopic biopsy samples from the dog and cat: A report from the World Small Animal Veterinary Association gastrointestinal standardization group. J Comp Pathol 2008; 138 (Supplement 1): S1-S43.
16. Jennings JL, Sait LC, Perrett CA, et al. Campylobacter jejuni is associated with, but not sufficient to cause vibrionic hepatitis in chickens. Vet Microbiol 2011 року; 149: 193-199.
17. Van Doorn LJ, Verschuuren-van Haperen A, Burnens A, et al. Rapid identification of thermotolerant Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari, and Campylobacter upsaliensis from various geographic locations by a GTPase-based PCR-reverse hybridization assay. J Clin Microbiol 1999; 37: 1790-1796.
18. Murphy H, Cogan T, Hughes R, et al. Porcine intestinal epithelial responses to Campylobacter infection. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2011 року; 34: 489-495.
19. Murphy H, Cogan T. Humphrey. Direction of neutrophil movements by Campylobacter-infected intestinal epithelium. Microbes Infect 2011 року; 13: 42-48.
20. Casamian-Sorrosal D, Willard MD, Murray JK, et al. Comparison of the histopathologic findings in biopsies from the duodenum and ileum of dogs with enteropathy. J Vet Intern Med 2010 року; 2010: Додати 80-83.
21. Scott KD, Zoran DL, Mansell J, et al. Utility of endoscopic biopsies of the duodenum and ileum for diagnosis of inflammatory bowel disease and small cell lymphoma in cats. J Vet Intern Med 2011 року; 25: 1253-1257.
22. Fox JG. Enteric bacterial infections: Campylobacter. In: Greene CE, ed. Infectious Diseases of the Dog and Cat, 3rd ed. St.Louis, MO: Elsevier Saunders; 2006: 339-343.
Авторське дозвіл на переклад і публікацію даного матеріалу отримано.
СВМ № 1/2017
1.aspx?
