Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

1. Сенсибілізація мишей з Ovalbumin

1. Приготуйте розчин OVA (клас В; Sigma, MO) в стерильному PBS в концентрації 1 мг / мл (розчин можна зберігати при температурі -80 ° С).
2. Для того щоб підготувати OVA-алюм суміш, візьміть Галун в трубку і додати OVA рішення в моді в той час як по краплях струшуючи трубу в співвідношенні 1: 1. Розмішайте суміш протягом 30 хвилин і використовувати відразу після змішування.
3. За допомогою 1 мл шприц, вводять 0,2 мл суміші в черевну порожнину мишей і повторити ін'єкцію через 2 тижні.

2. Інтраназально Проблема Миші з FITC Маркований Ovalbumin

1. 7 днів після другої ін'єкції OVA-алюм, мишей готові бути оскаржені интраназально ОВА-FITC.
2. Приготуйте розчин ОВА-FITC (Sigma) за допомогою стерильної PBS в концентрації 1 мг / мл і зберігають в аліквоти при -80 ° C.
3. Покладіть стерильну марлю в нижній частині 50 мл сокіл трубку і в хімічній чдревесіни, додають 5 мл Aerrane на марлю. Для того, щоб знеболити мишей, направити тварина в трубу приблизно на 5-10 секунд.
4. Тримайте під наркозом тваринам у вертикальному положенні і стерильні наконечники, піпетки 100 мкл FITC ОВА-рішення на ніздрі мишей в краплях моди.
5. Повторіть интраназального проблеми з ОВА-FITC протягом найближчих двох днів.

3. Підготовка Single-клітинної суспензії з легких і лімфатичних вузлів зливу

1. Жертвопринесення мишах внутрішньочеревно введення Euthanyl.
2. З метою зниження забруднення макрофагів, які можуть ускладнити постійного аналізу, легких здійснюється промивання. Для промивання легенів, трахеї миші коротко викрито і канюлю з катетер і шприц, використання крижаний PBS з 5 мМ ЕДТА, нижніх дихальних шляхів, промивають 3 рази для видалення клітин з альвеолярного простору.
3. Заливати легкі з 10 мл PBS, що містить 10 ОД / мл печінки через правий шлуночок серця, для видалення клітин крові з легких судин. Виконайте перфузії до легких стають білими, що свідчить про видаленні більшості клітин крові. Це особливо важливо, щоб видалити забруднення клітин з периферичної крові.
4. Проаналізуйте легкі і видалити лімфатичні вузли середостіння (МЛН) і помістити в лімфатичні вузли в окремому блюді. (Постарайтеся звести до мінімуму вплив на тканини, на світло, щоб запобігти гасіння флуоресценції FITC).
5. Помістіть легких на чашку Петрі і пропустити через м'ясорубку з допомогою ножиць. Наступна переварити легких протягом 25 хвилин при температурі 37 ° C допомогою 250 од / мл колагенази D (Roche) та додати ЕДТА (10 мМ кінцевої концентрації) протягом наступних 5 хвилин, щоб зупинити активність колагенази.
6. Передача фрагментів перетравлюється легкі через сито 100 мкм і клітини виконують гіпотонічний лізис для видалення еритроцитів. Суспензії окремих клітин, готова до подальшого аналізу DC.
7. З метою підготовки суспензії окремих клітин від млн тоблегчіть МЛН з використанням тонких голок і дайджест колагенази, як описано вище слід напруги через осередки фільтра.

4. Фарбування для постійного маркерів для оцінки дозрівання / міграція

1. Для того щоб визначити домену в легких, фарбування виконується для CD11c і CD11b. Крім того, щоб оцінити для дозрівання, фарбування виконується для CD86 і CD80, які upregulated як контролери домену пройти дозрівання. CD11c + CD11b + OVA-FITC + клітин в МЛН визначені як легеневий домену переході від легких до МЛН у відповідь на проблеми дихальних шляхів OVA.
2. Призупинити клітин в концентрації 10 х 10 6 клітин / мл в FACS буфером (PBS з 1% FBS і 1 мМ ЕДТА) і аліквоти 150 мкл суспензії клітин / трубка для фарбування FACS. Для ідентифікації легких домену, після фарбування необхідно: Незабарвлені управління (клітини легенів від мишей не береться OVA-FITC), ОВА-FITC контролю, CD11c один елемент управління, CD11b один елемент управління, CD11b + + CD11c подвійний контроль, CD11b + OVA-FITC + подвійний контроль, CD11c + OVA-FITC + подвійний контроль, MHC II єдиний орган управління, CD86 один елемент управління, CD80 єдиного управління та зразки фарбували OVA-FITC + + CD11c CD11b + + MHCII, ОВА-FITC + CD11c + CD86 + CD11b + і OVA-FITC + CD11c + CD80 + CD11b +.
3. Для оцінки DC міграції, виконує абсолютна кількість клітин в суспензії окремих клітин від МЛН, а потім підготувати наступні труби: Незабарвлені управління (МЛН клітин мишей не береться OVA-FITC), ОВА-FITC контролю, CD11c + один елемент управління, CD11b + подвійний контроль , CD11b + OVA-FITC + подвійний контроль, CD11c + OVA-FITC + подвійний контроль і CD11c + CD11b + OVA-FITC + зразки.

5. Представник Результати

Моменти часу, необхідне для внутрибрюшинного сенсибілізації, щоб викликати алергічне запалення дихальних шляхів є важливим і має здійснюватися, як показано на малюнку 1. Після внутрибрюшинного сенсибілізації і проблеми дихальних шляхів OVA, щоб підтвердити індукції алергічного запалення дихальних шляхів, деяких мишей можна пожертвувати і гістологічні дослідження можуть бути проведені на легких розділів, як показано на малюнку 2. Наявність запальних клітин може бути підтверджено гематоксилин-е Зіном (рис. 2A) і наявності слизу може бути оцінений за періодичною-кислотно-Шифф пляма (рис. 2В). Всього це підтвердить індукції алергічного запалення дихальних шляхів після ОВА завдання ОВА-сенсибілізованих мишей 8. На відміну від легких профілів з солоною мишей, як очікується, бути вільним від будь-яких запалень, а також відсутність слизу. Крім того, такі завдання OVA, легенева домену недеформованою РГО дозрівання і подальшого переходу на дренаж лімфатичних вузлів. Аналіз CD11c + клітин в лімфатичні вузли середостіння (МЛН) у мишей чутливих і стикаються з проблемою OVA, як очікується, показують більш високу частку CD11c + клітин в порівнянні з фізіологічним розчином мишей, які отримували (рис. 3А). Крім того, аналіз абсолютної кількості клітин в CD11c + CD11b + OVA-FITC + клітин в млн. OVA-чутливих і закликав мишей, як очікують, покаже значно вище (тобто в кілька разів вище) кількість, що колеги з сольових мишей (Малюнок 3B).

Малюнок 1. Експериментальний протокол для індукції овальбуміна (OVA), індукованого алергічного запалення дихальних шляхів у мишей, а також дихальних шляхів, проблеми з FITC позначені овальбуміна (OVA-FITC).

fig2.jpg "/>
Малюнок 2. OVA сенсибілізації слід OVA проблеми дихальних шляхів призводить до індукції алергічного запалення дихальних шляхів, як це визначено гематоксилін-еозином легких розділах показано в (A), а також призводить до слизу в дихальних шляхах, визначених періодичного фарбування Шифф кислота легких розділів, як показано на (B).

Малюнок 3. ОВА-FITC проблема викликає DC міграції з легких в лімфатичні вузли середостіння (МЛН). (A) ділянки проточної цитометрії зображують пропорції CD11c + клітин в МЛН контролю або OVA-чутливих мишей. (Б) Абсолютна пунктам CD11c + CD11b + OVA-FITC + клітин в МЛН фізіологічного розчину або OVA-чутливих мишей. * Р <0,05. Натисніть тут, щоб збільшити малюнок .