ДНК-діагностика: ПЛР-аналіз

ДНК-діагностика - це один з найбільш сучасних високотехнологічних методів дослідження, який широко застосовується в діагностиці інфекційних захворювань, дозволяючи виявляти навіть поодинокі мікроорганізми в організмі людини. У сучасній клінічній практиці ДНК-діагностика об'єднує кілька методів дослідження, найпоширенішим з яких є метод ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції).

Спочатку сам принцип методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) був розроблений Кері Мюлліса в 1983 р Відкриття полімеразної ланцюгової реакції стало одним з найбільш видатних подій в галузі молекулярної біології в останній чверті XX століття, і за розробку ПЛР-аналізу Керрі Мюлліса вже в 1993 р . був удостоєний Нобелівської премії в галузі хімії.

Аналіз методом ПЛР заснований на виявленні в матеріалі дослідження невеликого фрагмента ДНК збудника тієї інфекції, яку підозрює лікар. Говорячи «невеликий фрагмент ДНК», ми маємо на увазі «обривок» нуклеїнової ланцюжка довжиною всього в кілька сотень пар нуклеотидів - тоді як будь-яка, найпростіша ДНК включає в себе не менше кількох тисяч підстав. Такий підхід є найбільш ефективним при діагностиці внутрішньоклітинних паразитів і медленнорастущих мікроорганізмів, які потребують складних умов культивування для раніше використовувалися способів діагностики.

Завдяки високій точності визначення з'явилася можливість пошуку збудників хвороб практично в будь-якому біологічному матеріалі. Сьогодні методу ПЛР-аналізу піддаються:

• зішкріб епітеліальних клітин (зішкріб з уретри у чоловіків і у жінок, зішкріб з цервікального каналу);

• кров, плазма, сироватка крові;

• біологічні рідини (сік простати, плевральна, спинномозкова, навколоплідної, суглобова рідини, слина);

• сеча;

• мокрота;

• біопатов шлунка і дванадцятипалої кишки;

• слиз і інші біологічні виділення.

• Висока специфічність за рахунок того, що шукані шматочки генетичного матеріалу мають унікальні послідовності ДНК.

• Висока чутливість за рахунок багаторазового розмноження вихідного матеріалу.

• Універсальність - при правильному підході може бути проаналізований будь-який матеріал.

• Швидке отримання результату (на відміну від бактеріологічних методів, де результату доводиться чекати досить довго).

• Можливість одночасної діагностики багатьох збудників (анаеробів і аеробів; вірусів, бактерій і грибів).

• Для деяких мікроорганізмів ПЛР є практично єдиним методом діагностики (наприклад, для Mycoplasma genitalium).

ПЛР-аналіз може бути якісний і кількісний - т. Е. Може просто свідчити про наявність того чи іншого збудника, а може і давати інформацію про кількісний вміст збудника в тих чи інших біологічних матеріалах.

Достовірність результатів лабораторної діагностики ПЛР залежить не тільки від досвіду і професіоналізму лікаря-лаборанта, можливостей даної лабораторії, а й від того, дотримувався чи пацієнт рекомендації лікаря, наскільки правильною була його підготовка до проведення аналізу. При здачі аналізу методом ПЛР лікарі рекомендують дотримуватися таких правил:

• за добу до проведення аналізу не жити статевим життям;

• здача ПЛР-аналізу крові проводиться натщесерце, т. Е. Необхідно нічого не їсти, не пити і не жувати жуйку;

• для ПЛР-аналізу сечі використовується перша ранкова порція, зібрана в стерильний контейнер.

У усталеною клінічній практиці ПЛР-аналізи зазвичай здають «блоками [16] »На певні групи збудників.

наприклад:

• ПЛР-діагностика інфекцій, що передаються статевим шляхом, де одночасно виявляються:

- бактеріальні інфекції: Chlamydia trachomatis (хламідія), Mycoplasma hominis (мікоплазма людини), Gardnerella vaginalis (гарднерела), Mycoplasma genitalium (мікоплазма генітальна), Ureaplasma parvum (уреаплазма парвум), Ureaplasma urealyticum (уреаплазма уреалітікум), Neisseria gonorrhoeae (гонококи);

- вірусні інфекції: HPV (Human Papillomavirus, папіломавірус людини) типи 16, 31, 33, 35Н, 52, 58, 67; типи 18, 45, 39, 59; тип 6, 11; тип 26, 51;

- інфекції, викликані найпростішими: Trichomonas vaginalis - трихомонади;

- грибкові інфекції: Candida albicans - кандида;

• ПЛР-діагностика бактеріальних інфекцій:

- бруцели: Brucella species викликає захворювання дихальних шляхів, сечовидільної системи, органів статевої сфери і опорно-рухового апарату;

- гемофілія: до теперішнього часу відомо 9 видів гемофілів, що викликають інфекції у людини. Haemophilus ducrei викликає інфекції, що передаються статевим шляхом (симптоми - рясні водянисті, періодично гноевідние виділення з неприємним запахом з статевих шляхів, дизуричні явища). Haemophilus speciec викликає захворювання дихальних шляхів (симптоми - ураження дихальних шляхів, кашель з мокротою, підвищення температури тіла, слабкість, нездужання);

- кампілобактерії: Сampulobacter species викликає запальні захворювання статевих органів у жінок і чоловіків з наступними симптомами:

- дизуричніявища (невеликі різі при сечовипусканні);

- слизисто-гнійні виділення зі статевих шляхів;

- тягнуть болі внизу живота;

- лістерії: Listeria monocytogenes викликає захворювання відділів малого таза, сечовивідних шляхів, суглобів, органів дихання з наступними симптомами:

- слизисто-гнійні виділення зі статевих шляхів;

- болі внизу живота;

- набряк суглобів, болі в суглобах;

- кашель з мокротою;

- дизуричніявища;

- мікобактерії туберкульозу: розвиток туберкульозної інфекції викликають 4 види мікобактерій: Mycobacterium tuberculosis; Mycobacterium bovis; Mycobacterium africanum; Mycobacterium microti. Однак в патогенезі туберкульозу у людини провідна роль належить саме Mycobacterium tuberculosis. У всьому світі щороку реєструють близько 8 мільйонів нових випадків цього важкого захворювання, близько 3 мільйонів чоловік щорічно вмирає від туберкульозу;

- мікоплазми: внутрішньоклітинні мікроби, дуже широко поширені в природі. Уреаплазми - це особлива і найбільш «популярна» різновид патогенних для людини мікоплазм. На їх частку припадає більша частина хронічних мікоплазмозів людини. Крім уреаплазм відомо ще кілька видів безумовно патогенних для людини видів: Mycoplasma species, Mycoplasma pneumonia, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum. Найбільш часто патогенними видами мікоплазм уражаються:

- сечостатеві органи: пієлонефрит, уретрит, порушення овуляції і сперматогенезу;

- серцево-судинна система: артеріальна гіпотензія (гіпотонія), кардит, перикардит;

- органи травлення: невірусні гепатит, гастрит, холецистит, кишкові дисфункції (наполегливі діареї);

- респіраторні органи: ГРЗ, хронічний риніт, атипова пневмонія (не плутати з азіатською «атипові пневмонією»!);

- суглоби: ревматоїдний артрит, подагра;

- центральна і периферична нервова система: неврастенії, невралгії, локальні больові синдроми і, за деякими даними, демієлінізуючі захворювання;

- шкіра та слизові оболонки: підвищена ламкість і проникність капілярів, вульгарні вугри, простий герпес (мікоплазми беруть участь в транспорті вірусу);

- нейсерії: для людини патогенними є Neisseria gonorrhoeae і Neisseria meningitides, також у людини виділяють непатогенні види N. sicca, N. mucosa, N. perflava. Neisseria gonorrhoeae є збудником специфічного венеричного захворювання - гонореї;

- стрептококи: більшість стрептококів входять до складу нормальної мікрофлори дихальних, сечових, статевих шляхів і шлунково-кишкового тракту, але деякі їх види мають важливе значення як збудники хвороб людини:

- стрептококи групи A (Streptococcus pyogenes) викликають ангіну - одну з найпоширеніших серед дітей шкільного віку інфекцій, а також широко відомі постінфекційні захворювання - ревматизм і гострий гломерулонефрит;

- стрептококи групи В (Streptococcus agalactiae) - основні збудники сепсису і менінгіту у новонароджених, післяпологового сепсису і ендометриту;

- трепонема: Treponema pallidum - збудник сифілісу;

- хелікобактер пілорі: встановлена чітка зв'язок Helicobacter pylori з розвитком гастриту, виразкової хвороби шлунка і дванадцятипалої кишки, раку шлунка і багатьох інших захворювань.

• ПЛР-діагностика вірусних гепатитів, герпесу та інших вірусних інфекцій:

- вірус Епштейн-Барр (з сімейства герпесвірусів) викликає легке захворювання у дітей і інфекційний мононуклеоз у неімунізованих підлітків і дорослих, є всюдисущої вірусною інфекцією і присутній практично у 100% популяції людей. Найчастіше зараження їм відбувається в ранньому дитячому і в юнацькому віці, тому більше 90% дорослих вже перенесли цю інфекцію в тій чи іншій формі і мають антитіла до вірусу Епштейн-Барр;

- герпес: найпоширеніша вірусна інфекція. Близько 90% людей на землі інфіковані герпесом. Тільки у 5% інфікованих виявляються симптоми хвороби, у решти вона протікає без клінічних проявів. Найбільш часто вірус вражає: очі (кон'юнктивіт, кератит), слизову губ, слизові оболонки статевих органів, центральну нервову систему (енцефаліт, менінгіт). У вагітних жінок вірус може викликати патологію вагітності, мимовільні аборти, передчасні пологи;

- вірусні гепатити - це гепатити, викликані вірусною інфекцією: А, В, С, G;

- цитомегаловірус: це ціла група вірусів, які можуть бути присутніми в будь-якої рідини організму людини (кров, сеча, слина, сперма, секрет піхви, грудне молоко і т. Д.). Цитомегаловірус багато в чому схожий з вірусом простого герпесу, тому його відносять до різновиду герпетичних інфекцій. Цитомегаловірус як хвороба може розвинутися в результаті ослаблення захисних реакцій організму: на тлі сильних стресів, грипу, загострення хронічних захворювань, ускладнень вагітності;

- інші вірусні інфекції: ВІЛ, вірус Варіцелла-Зостер, ентеровірус;

• ПЛР-діагностика гострих кишкових і респіраторних інфекцій:

- респіраторні інфекції: аденовіруси, грип А і В, на РНК вірусу грипу A, A / H1N1 / CA / 2009 (аналіз на свинячий грип);

- вірусні кишкові інфекції: Астровіруси, норовіруси 1-го і 2-го типів, ротавіруси А і С, саповірус;

- бактеріальні кишкові інфекції: Е. Coli (ентеротоксигенні штами), Shigella (геморагічні штами), Salmonella typhi, Salmonella species, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis.