- Вступ Проблема вірусних гепатитів (ВГ) займає домінуюче місце серед усіх захворювань печінки і є...
- Результати та їх обговорення
- Висновки
Вступ
Проблема вірусних гепатитів (ВГ) займає домінуюче місце серед усіх захворювань печінки і є однією з найбільш актуальних в сучасній гепатології. З цими інфекціями пов'язано більшість випадків летальних результатів у хворих з гострими вірусними гепатитами, а також випадки розвитку хронічних захворювань печінки, включаючи цироз і гепатоцеллюлярную карциному [1, 2]. Не можна не брати до уваги той факт, що тривалий перебіг хвороби з затяжним періодом реконвалесценції і серйозними залишковими явищами обумовлює суттєві матеріальні збитки, пов'язані з витратами на безпосереднє лікування даного захворювання [2]. Така ситуація обумовлена, з одного боку, факторами господаря, зокрема, особливостями реагування імунної системи, з іншого - факторами вірусу, які дозволяють йому протистояти механізмам імунітету, виживати в макроорганизме, впливати на результати захворювання і ефективність проведеної противірусної терапії.
За останній час досягнуті значні успіхи у виявленні маркерів вірусних гепатитів, в розкритті патогенетичних механізмів, що забезпечують санацію організму від гепатотропних вірусів через цитолиз власних клітин, уражених вірусами [3-5]. Істотним досягненням сучасної клінічної медицини є широке використання і впровадження в лабораторну практику нових високоінформативних діагностичних технологій. Нові молекулярно-генетичні та імунологічні методи діагностики, такі як індикація специфічних антитіл до вірусів гепатитів за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), виявлення нуклеотидних послідовностей РНК і ДНК вірусів з подальшим визначенням генотипу не тільки в крові, але і в різних біологічних тканинах, значно розширили існуючі уявлення про етіологію і патогенез ВГ [6, 7]. Це дозволяє на більш ранніх стадіях виявити інфікованих осіб, встановити клінічну форму і характер перебігу захворювання [4]. Результати генотипування характеризуються великою однозначністю в порівнянні з іншими методами дослідження і надають безпосередню інформацію для виявлення еволюційних і епідеміологічних зв'язків різних ізолятів ВГ [6, 7].
В даний час молекулярно-генетичні методи типування ВГ складають основу молекулярної епідеміології вірусних гепатитів, метою якої є вивчення циркуляції окремих генетичних варіантів збудників і їх причинного зв'язку з виникненням і поширенням інфекційних захворювань.
Існуючі ізоляти вірусу гепатиту А (ГА, HAV) підрозділяють на 7 генотипів, які позначаються римськими цифрами від I до VII [4, 5]. Генотипи вірусу I, II, III і VII викликають захворювання у людини, а генотипи IV, V, VI - у мавп. Відмінності між ізолятів HAV, виділеними в різних регіонах світу з нуклеотидних послідовностей геномної РНК, складають 15-25%, а на рівні генотипів і субтипов - 7,5% відповідно. При цьому амінокислотні послідовності ізолятів HAV досить консервативні, що пояснює наявність всього одного серотипу у даного вірусу. За даними дослідників [19], найбільш важкий перебіг захворювання відзначається в осіб з генотипом IB, IIIA, тоді як середньотяжкі форми спостерігаються при генотипі IA.
Про гетерогенності популяції гепатиту В (ГВ, HBV) стало відомо ще в середині 70-х років минулого століття, коли експериментально серологічними методами було доведено існування субтипов поверхневого антигену вірусу - HBsAg. При цьому було знайдено одну спільну детермінанта «а», яка в комбінації з 2 додатковими детермінантами d / y і w / r утворювала 4 субтипу HBsAg: adw, ауw, adr, ауr. Пізніше були описані нові варіанти детермінант, і загальна кількість субтипов досягло 9. На підставі аналізу нуклеотидних послідовностей S-гена ізоляти HBV, виділені в різних регіонах світу, об'єднали в 8 основних генотипів, які назвали великими літерами латинського алфавіту: А, В, С, D, E, F, G і Н. Слід зазначити, що повна відповідність між генотипами HBV і серотіпамі HBsAg не встановлено. Так, ізоляти HBV, які відносяться до чотирьох абсолютно різних генотипів А, В, С і F, можуть мати один і той же серотип adw2 [5, 12, 16].
Вірус гепатиту С (ГС, HCV) серед інших ВГ характеризується найбільшою генетичною варіабельністю генома. Відповідно до класифікації, всі ізоляти HCV групуються в 6 головних генотипах, які позначаються арабськими цифрами від 1 до 6. Усередині кожного генотипу виділяють субтипу, які включають ізоляти, що складаються з квазівидів. На приналежність ізоляту до певного субтипу вказують прописні латинські букви, які пишуться слідом за арабською цифрою: HCVla, HCVlb, HCVlc, HCV2a і т.д. В даний час відомо більше 100 субтипов HCV [14, 21].
Відомі ізоляти HDV згруповані в 3 генотипу, які позначаються римськими цифрами - I, II, III [14, 21].
До теперішнього часу запропоновано виділяти 5 генотипів вірусу гепатиту G (ГG), у яких встановлена закономірність територіального поширення. Другий генотип ГG переважає в Північній Америці, Європі, Азії і Північній Африці, перший зустрічається тільки в Західній Африці, п'ятий - в Південній Америці, третій і четвертий - в Південно-Східній Азії. За даними дослідників, на території України, Росії та країн СНД домінує другий генотип [6].
У веріфіцированного в 1997 році ДНК-яке містить вірусу TTV розрізняють 16 генотипів - G1-G16, роль яких у патології печінки вивчається [1].
Таким чином, популяції ВГ налічують сотні генетичних варіантів. У зв'язку з цим використання рутинних лабораторних методів діагностики ВГ, заснованих на визначенні антигенів і антитіл, не може дати інформацію про особливості циркуляції різних варіантів ВГ серед населення, про наявність зв'язку між ізолятів ВГ, виділеними як від окремих пацієнтів, так і груп пацієнтів, залучених у спалаху, кількість яких за останні роки значно зросла.
На жаль, вивчення генотипів облігатно-гепатотропних вірусів, що циркулюють на території України, та їх впливу на перебіг та наслідки захворювання є вкрай слабкою ланкою в роботі лабораторної служби України.
Мета дослідження: на підставі генодіагностіческіх досліджень вивчити клінічний перебіг, тяжкість і наслідки вірусних гепатитів з різноманітними механізмами передачі інфекції.
Основні завдання дослідження:
1. Провести генотипування HAV, HBV, HDV, HCV і виявити РНК І ДНК НGV і TTV, визначити циркулюючі генотипи і їх субтипу в досліджуваних регіонах.
2. Виявити можливі відмінності в клінічних проявах захворювання в залежності від встановлених генотипів і геноваріантов вірусів.
3. Встановити зв'язок з клінічними проявами хвороби у хворих на ВГ.
матеріали та методи
Результати нашої роботи базуються на обстеженні 141 хворого ГА в різних регіонах України; 163 хворих на гострий ГВ (ОГВ) в Харківському регіоні, 76 хворих ОГВ і 54 хворих на хронічний ГВ (ХГВ) в Закарпатському регіоні; 155 хворих на HCV-інфекцією: гострий ГС (ОГС) встановлено у 37 хворих, хронічний ГС (ХГС) - у 117.
Діагноз встановлювався відповідно з урахуванням комплексу клініко-епідеміологічних, лабораторно-інструментальних даних обстеження і підтверджувався виявленням в сироватці крові специфічних серологічних маркерів ВГ (анти-наV IgM, HBsAg, анти-HBcIgM, анти-HBcIgG, HBeAg, анти-НВе, анти-НСV (сум.), анти-HCV IgM і IgG, анти-HCV core і анти-HCV NS-3, NS-4, NS-5, анти-НDV IgM) методом ІФА (ELISA) за допомогою тест-систем НВО «Діагностичні системи »(Росія) і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (РНК HAV, ДНК НВV і РНК HDV, PHK HCV, РНК HGV і ДНК TTV). Клініко-патогенетичні варіанти перебігу, форму і ступінь тяжкості ВГ визначали відповідно до загальноприйнятих у клінічній практиці критеріями (МКБ-10).
Матеріалом для наших досліджень була сироватка крові хворих в різні періоди захворювання (розпалу, видужання).
Молекулярно-біологічні дослідження включали визначення реплікативної активності ВГ на підставі виявлення в сироватці крові РНК і ДНК досліджуваних вірусів методом ПЛР з використанням тест-систем ЦНДІ епідеміології МОЗ РФ. Генотипування вірусів проводилося з використанням рестрикционного аналізу за методом М. Мizokami з співавт. (1999) в модифікації ЦНІІЕ р Москви.
Отримані результати досліджень статистично оброблені з використанням методів варіаційної статистики, що здійснювалося за допомогою програм Exсel-2002 і Statistiсa for Windows (Statsoft Inc., США) на комп'ютері з процесором CPU Athlon 64-3200 Tray.
Результати та їх обговорення
Виявлення та обстеження хворих на ГА, як зазначалося, проводилося в різних регіонах України. Серед обстежених хворих (n = 141) у 16% була виявлена мікст-інфекція (HAV і HBV - у 9,6% і HAV і HCV - у 6,4%).
При генотипуванні вірусу ГА у 75% випадків (105 хворих) було виявлено генотип 1А вірусу ГА, у 36 пацієнтів - генотип 3А, що склало 25% (рис. 1).
Питома вага різних генотипів ГА у хворих в різних регіонах України представлений на рис. 2.
Слід зазначити, що в Закарпатській, Полтавській і Миколаївській областях серед спорадичних випадків ГА був виявлений тільки домінуючий генотип 1А.
Важливо відзначити, що при вивченні тяжкості перебігу ГА в залежності від виявленого генотипу нами було встановлено, що в осіб з генотипом 3А відзначається більш важкий перебіг хвороби в порівнянні з таким у хворих з генотипом 1А (рис. 3).
Таким чином, генотипування вірусу ГА у хворих з різним перебігом захворювання дозволило ви-явити два генотипу: 1А і 3А. Генотип 1А є домінуючим серед спорадичних випадків захворювання ГА, оскільки його частота становить 75%, а генотип 3А зустрічався значно рідше - у 25% хворих.
Клінічно у пацієнтів з встановленим генотипом 1А наV перебіг захворювання був циклічно з різним ступенем тяжкості, однак превалювали легкі форми (61 і 39%), тоді як у хворих з генотипом 3А реєструвався більший відсоток середньо форм хвороби (42 і 58% відповідно).
При генотипуванні вірусу ГВ у 84,5% хворих (n = 208) було встановлено генотип D вірусу ГВ, у 17 пацієнтів - генотип А, що склало 8,4%. Кількість хворих, у яких була виявлена ДНК НВV, але генотип вірусу встановити не вдалося, - 14 чол. (7,1%) (рис. 4).
За результатами генодіагностіческіх досліджень з визначенням генотипів вірусу ГВ у пацієнтів з ОГВ встановлено значне переважання як в Харківському, так і в Закарпатському регіонах генотипу D (90,8 і 71,1%) і рідкісна зустрічальність генотипу А (2,5 і 19,7 % відповідно).
Слід зазначити, що частота виявлення генотипу А HBV в Закарпатському регіоні значно перевищувала таку серед пацієнтів з гострою НВV-інфекцією в Харківському регіоні - 19,7 і 2,5% відповідно, що свідчить про особливості територіального поширення генотипів НВV в Україні.
При обстеженні хворих ХГВ була зареєстрована майже однакова частота як генотипу А, так і генотипу D HBV - 41,8 і 39,2% відповідно. Деякі фахівці вважають, що генотип А вірусу ГВ має нижчу антигенность в порівнянні з генотипом D і внаслідок цього - більш низьку здатність ніж генотип D, індукувати імунну відповідь, тому даний генотип асоціюється з великим ризиком розвитку хронічного гепатиту.
Для виявлення можливого взаємозв'язку між клінічними проявами хвороби і генотипом НВV нами проводилося порівняння частоти окремих клінічних симптомів залежно від встановленого генотипу вірусу (табл. 1).
Дані табл. 1 показують, що у пацієнтів з генотипом А частіше зустрічалася тяжкість в епігастрії - у 80%, тоді як в осіб з генотипом D - в 46,3% випадків (р <0,05). Свербіж шкіри - у 46,7 і 18,5% випадків відповідно (р <0,05). Також значно частіше у хворих з генотипом А в порівнянні з генотипом D відзначалися: нудота - у 93,3% випадків (р> 0,05), артралгії - в 20% випадків (р> 0,05), підвищення температури тіла - в 33% випадків (р> 0,05), однак зазначені значення не відрізнялися статистичною достовірністю.
Аналізуючи дані деяких біохімічних показників у пацієнтів з ОГВ в залежності від виявленого генотипу, було встановлено, що для осіб з генотипом А НВV властиве більш виражене підвищення активності трансаміназ (аланінамінотрансфераза (АлАТ) в гострому періоді підвищувалася до 7,5 ± 0,4 ммоль / л · год, в той час як у хворих з генотипом D - до 5,3 ± 0,2 ммоль / л · год; р <0,05) (табл. 2). Рівень загального білка в групі хворих з генотипом А мав тенденцію до зниження (60,9 ± 3,2 г / л) в порівнянні з відповідним показником у хворих з генотипом D (69,5 ± 2,9 г / л) (р < 0,05).
При порівнянні частоти клінічних проявів ХГВ залежно від встановленого генотипу HBV у осіб, які перебували під нашим спостереженням, також були виявлені деякі відмінності (табл. 3).
Прояви диспептичного синдрому частіше зустрічалися у осіб з генотипом А HBV в порівнянні з такими у пацієнтів з генотипом D: зниження апетиту (96,8% проти 69,7%), нудота (54,8% проти 18,2%), тяжкість в правому підребер'ї (93,5% проти 54,5% випадків) (р <0,05).
У хворих з генотипом А HBV також значно частіше відзначалися болі при пальпації в правому підребер'ї, при цьому середні показники відрізнялися статистичною достовірністю (р <0,05). Це корелювало зі скаргами цих хворих на тяжкість в правому підребер'ї (р> 0,05). Крім того, у хворих ХГВ з генотипом А HBV жовтяниця виявлялася в 2,5 рази частіше, ніж у пацієнтів з генотипом D, - 22,6% проти 9,1% (р <0,05). У всіх пацієнтів з ХГВ з встановленими генотипами А і D HBV відзначалися загальна слабкість і гепатомегалія.
Вивчаючи біохімічні показники сироватки крові у хворих ХГВ залежно від встановлених генотипів HBV, було виявлено (табл. 4), що показники активності АлАТ перевищували у осіб з генотипом А (5,6 ± 0,8 ммоль / л · год) такі при генотипі D, які в середньому становили 3,7 ± 0,4 ммоль / л · год (р <0,05).
У пацієнтів з генотипом А рівень загального білірубіну перевищував такий у пацієнтів з генотипом D - 85,9 ± 10,5 мкмоль / л і 58,4 ± 9,2 мкмоль / л (р <0,05) відповідно.
Диспротеінемія при запально-некротичних процесах печінкової тканини також була трохи вищою в групі хворих з генотипом А. Так, концентрація гамма-глобуліну у хворих з даними генотипом становила 31,4 ± 2,6 г / л, а з генотипом D - 28,2 ± 1,8 г / л (р> 0,05). Отримані результати біохімічних досліджень ураження печінки свідчать про більш високу активність інфекційного процесу у хворих ХГВ з генотипом А на відміну від пацієнтів з генотипом D.
Вивчення особливостей клінічних проявів гострої і хронічної HBV-інфекції в залежності від встановленого генотипу показало, що у хворих, інфікованих генотипом D HBV, спостерігалося більш м'яке протягом як гострого, так і хронічного ГВ з менш вираженою клінічною симптоматикою, з помірним проявом мезенхимально-запального і цитолитического синдромів і помірними біохімічними змінами в сироватці крові хворих. І навпаки, у пацієнтів з генотипом А НВV відзначається більш виражене перебіг хвороби з пре-володінням диспептических проявів, з більшою активністю некробиотических і запальних процесів у печінці. Все це підкреслює вищу вірулентність і імуногенність генотипу А НВV, з більш частим розвитком хронізації процесу у цієї групи хворих.
Для вивчення генотипів HDV нами було обстежено 155 хворих з HBV-інфекцією: 76 хворих - з ОГВ і 79 - з ХГВ. Серед обстежених у 18 хворих (11,6%) була виявлена РНК HDV, з них 7 чоловіків (38,8%) і 11 жінок (61,2%) (рис. 5).
Аналіз отриманих результатів показав, що серед пацієнтів з ОГВ РНК HDV була виявлена у 7 хворих, що склало 9,2%, тоді як серед пацієнтів з ХГВ РНК HDV верифицирована в 13,9% (11 пацієнтів). При цьому було встановлено І генотип вірусу, субтип а. Згідно з даними дослідників, саме цей генотип обумовлює легкі форми інфекції з високою частотою хронізації процесу, тоді як генотип ІІ відрізняється менш патогенні властивості. Генотип III пов'язують з розвитком фульмінантних форм HDV-інфекції.
Для визначення циркулюючих генотипів HCV було обстежено 155 хворих на HCV-інфекцією, серед них ОГС встановлений в 23,9% випадків, ХМР - в 76,1% випадків. Частота виявлення окремих генотипів HCV представлена на рис. 6.
Аналізуючі результати молекулярно-генетичних ДОСЛІДЖЕНЬ, ВСТАНОВИВ, что РНК НСV визначавши в крови всех Хворов ОГС та у 77,89% Хворов на ХГС. Генотип HCV 1b оказался найбільш Поширення среди Хворов як ОГС (50%), так и ХМР (43,3%). Друге місце зайнять генотип 3а, Який реєструвався у 30 и 38,3% Хворов ОГС та ХГС відповідно. У Хворов ОГС з однакової частотою зустрічаліся комбінація 1b / 3а та 2 генотіпів HCV - у 10% Хворов відповідно. Комбінація генотіпів 1а / 3а та ізольованій моногенотіп 1а среди Хворов ОГС НЕ віявлявся. У тій же година у хворого на ХГС комбінація генотіпів 1b / 3а - у 6,7%. З однаковою частотою (5,0%) реєструвалися комбінації генотипів 1а / 3а та 3а моногенотіп. Частота реєстрації 2 генотипу була найбільш рідкісної - всього у 1,7% хворих на ХГС.
Стан імунної регуляції у хворих НСV-інфекцією, як відомо, залежить від реплікативної активності вірусу, його генотипу, цитолітичної активності ГС. В результаті проведених імунологічних досліджень встановлено, що у хворих ОГС та ХГС з генотипом 3а HCV спостерігається превалювання клітинної ланки імунітету, тоді як при генотипі 1b - гуморального.
У крові хворих на ХГС в міру зростання ступеня біохімічної активності відзначається статистично достовірне зниження рівнів клітинних імунних показників поряд з одночасним підвищенням показників гуморального ланки імунітету.
На предмет інфікування HGV- і ТТV-вірусами в Україні нами було обстежено хворі гострими і хронічними формами HBV-інфекції.
При обстеженні 76 хворих ОГВ в 14,47% (11 пацієнтів) методом ПЛР була виявлена РНК HGV. У той час як з 79 хворих ХГВ даний вірус був виявлений тільки в 5% випадків (4 хворих) (рис. 7).
Проведений аналіз на наявність ДНК ТТV методом ПЛР дозволив виявити серед хворих на гостру НВV-інфекцією вірус TTV в 72,8% (51 хворий) (рис. 8).
Слід зазначити, що при порівнянні окремих даних клінічних проявів хвороби і біохімічних змін, а також тривалості стаціонарного лікування достовірних відмінностей між ТТV-позитивними і ТТV-негативними групами хворих ОГВ виявлено не було, що вимагає більш детального вивчення цього явища на більшій кількості пацієнтів.
Висновки
1. Генетичні особливості вірусів гепатитів можуть визначати перебіг та наслідки інфекційного процесу.
2. Генотипические особливості вірусів можуть бути маркерами прогнозу ефективності противірусної терапії і стійкості вірусів до використовуваних препаратів.
3. Для більш повного розуміння патогенезу захворювання необхідне вивчення генетичних особливостей збудника на різних рівнях гетерогенності.
список літератури
1. Вінницька Є.В. ТТV-інфекція. Сучасний стан проблеми // Сучасні інфекції. - 2005. - № 3-4. - С. 87-91.
2. Жданов К.В. Латентні форми вірусних гепатитів В і С у осіб молодого віку: Автореф. дис ... д-ра мед. наук. - СПб., 2000. - 42 с.
3. Івашкін В.Г., Маммаев С.Н., Буеверов А.О., Шульпекова Ю.О. і ін. Механізми імунного «вислизання» при вірусних гепатитах // Ріс. журн. гастроентерол., гепатол. і Колопроктол. - 2000. - № 5. - С. 7-12.
4. Каретний Ю.В., Каганов Б.С., Добротвірської І.Л. Вірусний гепатит А: стан проблеми // Питання сучасної педіатрії. - 2004. - Т. 3, додаток № 4. - С. 70-78.
5. Мукомолов С.Л., Калініна О.В. Молекулярна епідеміологія вірусних гепатитів // Світ вірусних гепатитів. - 2003. - № 11. - С. 2-7.
6. Новиков Д., Мохонов В. GV вірус С / вірус гепатиту G // Світ вірусних гепатитів. - 2001. - № 2. - С. 2-4.
7. Сучков С.В., Москалець О.В., Черепахина Н.Є., Бурдакова Ю.А. та ін. Сучасні підходи імуно-та генодиагностики в клінічній практиці // Тер. арх. - 2004. - № 4. - С. 78-83.
8. Acute renal failure complicating nonfulminant hepatitis А in HLA-B27 positive patient / N. Brncic, D. Matic-Glazar, I. Viskovic [et аl.] // Renal. Failure. - 2000. - Vol. 22, № 5. - P. 635-640.
9. Allain JP Genomic screening for blood-borne viruses in transfusion setting // Clin. Lab. Haematol. - 2000. - № 22. - Р. 1-10.
10. Fredericks DN, Relman DA Application of polymerase chaine reaction to the diagnosis of infectious diseases // Clin. Infect. Dis. - 1999. - № 29. - Р. 475-488.
11. Fulminant hepatitis A in indigenous children in north Queensland / JN Hanna, TH Warnock, RW Shepherd [et аl.] // Med. J. Aust. - 2000. - Vol. 172, № 1. - P. 19-21.
12. Grandjacques С., Pradat P., Stuyver L. et al. Rapid defection of genotypes and mutations in the pre-core promoter and the pre-core region of hepatitis B virus genome: correlation with viral persistence and disease severity // J. of Hepatology. - 2000. - № 33. - Р. 430-439.
13. Guo J.-T., Zhou H., Liu C., Aldrich C., Saputell J., Whitaker T., Barrasa M.-I., Mason W.-S., Seeger C. Apoptosis and regeneration of hepatocytes during recovery from transient hepadnavirus infections // J. Virol. - 2000. Feb. - 74 (3). - Р. 1495-1505.
14. Guttmacher AE, Collins FS Welcome to the genomic era // N. Engl. J. Med. - 2003. - 349 (10). - P. 996-998.
15. Heid CA, Stevens J., Livac KJ et al. Real time quantitative PCR // Genome Res. - 1996. - № 6. - Р. 986-994.
16. Kao JH, Chen PJ, Lai MY et al. Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B // Gastroenterology. - 2000. - Vol. 118, № 3. - Р. 554-559.
17. Kilian M .. Biological activities of Ig A / M. Kilian, ME Lamm, MW Russell // Mucosal. Immunology. - 1998. - Vol. 31. - P. 124-158.
18. Mayerat C., Mantegani A., Frei PC Does hepatitis B virus (HBV) genotype influence the clinical outcome of HBV infection? // J. of Viral Hepatitis. - 1999. - № 6. - P. 299-304.
19. Seelig R., Renz M., Seelig HP PCR in diagnosis of viral hepatitis // Ann. Med. - 1992. - Vol. 24. - P. 225-230.
20. Wolk D., Mitchell S., Patel R. Principles of molecular microbiology testing methods // Infect. Dis. Clin. N. Am. - 2001. - 15 (4). - P. 1157-1204.
21. Xheng X., Persing D. Genetic amplification techniques for diagnosis infectious diseases // Clin. Chem. - 1997. - 43 (11). - P. 2021-2038.
Frei PC Does hepatitis B virus (HBV) genotype influence the clinical outcome of HBV infection?
