швидкість ферментативної реакції , Як і активність ферменту , В значній мірі визначається також присутністю в середовищі активаторів і інгібіторів : Перші підвищують швидкість реакції , А другі гальмують цю реакцію . Активуючий вплив на швидкість ферментативної реакції надають різноманітні речовини органічної та неорганічної природи. так, соляна кислота активує дію пепсину шлункового соку;
жовчні кислоти підвищують активність панкреатичної ліпази ; деякі тканинні ферменти ( оксидоредуктаз , катепсини , Аргіназа), рослинна протеиназа і ін. В значній мірі активуються сполуками, що містять вільні SH-групи ( глутатіон , цистеїн ), А ряд ферментів - також вітаміном С . особливо часто активаторами виступають іони двовалентних і, рідше, одновалентних металів . Отримано докази, що близько чверті всіх відомих ферментів для прояву повної каталітичної активності потребують присутності металів . багато ферменти взагалі не активні під час відсутності металів . Так, при видаленні цинку вугільна ангидраза (карбоангидраза), що каталізує біосинтез і розпад Н2СО3, практично втрачає свою ферментативну активність ; більш того, цинк при цьому не може бути замінений ніяким іншим металом . відомі ферменти , Дія яких активується іонами декількох металів ; зокрема, енолаза активується Mg2 +, Mn2 +, К + (табл. 4.4).
Молекулярний механізм дії металів в ензиматичну каталізі , Або роль металів в активації ферментами . У ряді випадків іони металів (Со2 +, Mg2 +, Zn2 +, Fe2 +) виконують функції простетических груп ферментів , Або служать акцепторами і донаторамі електронів , Або виступають в якості електрофілов або нуклеофілів, зберігаючи реактивні групи в необхідної орієнтації. В інших випадках вони сприяють приєднанню субстрату до активного центру і утворення фермент-субстратного комплексу. наприклад, іони Mg2 + через негативно заряджену фосфатну групу забезпечують приєднання монофосфатних ефірів органічних речовин до активного центру фосфатаз , які каталізують гідроліз цих сполук. іноді метал з'єднується з субстратом , Утворюючи справжній субстрат , На який діє фермент . Зокрема, іони Mg2 + активують креатинфосфокиназа завдяки освіті істинного субстрату - магнієвої солі АТФ . Нарешті, є експериментальні докази прямої участі металів (Наприклад, іонів Са2 + в молекулі амілази слини) у формуванні та стабілізації активного центру і всієї тривимірної структури молекули ферменту . Слід зазначити також, що метали нерідко виступають в ролі аллостеріческіх модуляторів (ефекторів; див. рис. 4.22). Взаємодіючи з аллостерічес-ким центром, подібний метал (Ефектор) сприяє утворенню найбільш вигідною просторової конфігурації ферменту і активного фермент-субстратного комплексу.
аніони в фізіологічних концентраціях зазвичай неефективні або надають невелике активуючий вплив на ферменти . виняток становлять пепсин , деякі оксидоредуктаз , що активуються анионами , а також амілаза слини, що каталізує гідроліз крохмалю , активність якої підвищується при дії іонів хлору , і аденилатциклаза , Яка активується анионами галогенів .
інгібітори ферментів зазвичай прийнято ділити на два великі класи: оборотні та необоротні. це речовини , Що викликають часткове (оборотне) або повне гальмування реакцій , що каталізують ферментами . нещодавно відкриті антиферменти (Антіензіми, або антізіми), що представляють собою білки (або поліпептиди ), Що діють як інгібітори ферментів . До подібних речовин відносяться, наприклад, інгібітор трипсину , Виявлений в соєвих бобах, і сироватковий антитрипсин . Нещодавно відкритий в печінки тварин антиферменти орнітінде-карбоксилази (див. розділ 12). Антізіми, найімовірніше, утворюють важко-діссоцііруемие комплекси з відповідними ферментами , Вимикаючи їх з хімічних реакцій . іноді інгібітор є складовим компонентом попередника ферменту , наприклад пепсину (Див. Розділ 12), або входить до складу складних комплексів ферментів , Наприклад до складу протеїнкінази і протєїнфосфатаза, які каталізують процеси фосфо-рілірованія-дефосфорилирования в живих організмах . Однак до сих пір не з'ясовано, чи є подібні антиферменти істинними інгібіторами або регуляторними субодиницями, зокрема, яка різниця в призначенні регуляторної (R) субодиниці в складі протеїнкінази і ингибиторной (I) субодиниці в складі протєїнфосфатаза.
ферменти є білками , Тому будь-які агенти, що викликають денатурацію білка ( кислоти , лугу , солі важких металів , Нагрівання), призводять до незворотної інактивації ферменту . Однак подібне інак-тівірованіе щодо неспецифічно, воно не пов'язане з механізмом дії ферментів . Набагато більшу групу становлять так звані специфічні інгібітори , Які надають свою дію на будь-якої один фермент або групу споріднених ферментів , Викликаючи оборотне або необоротне інгібування. дослідження цих інгібіторів має важливе значення. По перше, інгібітори можуть дати цінну інформацію про хімічну природу активного центру ферменту , А також про склад його функціональних груп і природі хімічних зв'язків , Що забезпечують освіту фермент-субстратного комплексу. відомі речовини , Включаючи лікарські препарати, специфічно зв'язують ту чи іншу функціональну групу в молекулі ферменту , Вимикаючи її з хімічної реакції . Так, йодацетат IСН2-СООН, його амід і етиловий ефір , Пара-хлормеркурібензоат ClHg-С6Н4-СООН та інші реагенти порівняно легко вступають в хімічний зв'язок з деякими SH-групами ферментів . Якщо такі групи мають істотне значення для акта каталізу , То додавання подібних інгібіторів призводить до повної втрати активності ферменту :
R-SH + IСН2-СООН -> НI + R-S-CH2-COOH
Дія ряду інших ферментів (Холінестерази, трипсин і хімотріп-син) сильно гальмується деякими фосфорорганічними сполуками , наприклад ДФФ , Внаслідок блокування ключовий гідроксильної групи серина в активному центрі (Див. Раніше).
По-друге, інгібітори знайшли широке застосування в ензимології при дослідженні природи множинних форм ферментів і изоферментов , Що розрізняються не тільки електрофоретичної рухливістю, скільки різною чутливістю до одного і того ж інгібітору .
За допомогою інгібіторів , Що вимикають окремі стадії багатоступінчастого метаболічного процесу, можуть бути точно встановлені не тільки послідовність хімічних реакцій , А й природа беруть участь в цих перетвореннях ферментів . Цим шляхом, застосовуючи йодацетат, фториди та інші специфічні інгібітори , Був розшифрований Глік-літичний шлях окислювально-відновних перетворень глюкози до стадії освіти молочної кислоти в м'язової тканини , Що нараховує 11 стадій за участю 11 ферментів і 10 проміжних метаболітів .
З пригніченням ферментів пов'язаний механізм дії багатьох токсинів і отрут на організм . Відомо, що при отруєннях солями сенильной кислоти смерть настає внаслідок повного гальмування і виключення дихальних ферментів (Цитохромними система) тканин , особливо клітин мозку. Токсичний вплив на організм людини і тварин деяких інсектицидів обумовлено гальмуванням активності холінестерази - ферменту , Що грає ключову роль в діяльності нервової системи.
Сучасна, так звана раціональна, хіміотерапія (спрямоване застосування лікарських препаратів в медицині) повинна грунтуватися на точному знанні механізму дії лікарських засобів на біосинтез ферментів , на активність вже синтезованих ферментів або на регуляцію їх активності в організмі . Іноді для лікування деяких хвороб використовують вибірково діючі інгібітори . так, інгібітор ряду протеїназ ( трипсину , химотрипсина і калікреїну) трасилол широко застосовується для лікування гострого панкреатиту - хвороби, при якій рівень трипсину і химотрипсина в крові різко зростає. Знання виборчого інгібіторної дії деяких природних і синтетичних сполук (так званих антиметаболітів) на ферменти може слугувати методологічною основою для розробки ефективних методів синтезу хіміотерапевтичних препаратів. Цей шлях відкриває широкі можливості для спрямованого впливу на синтез ферментів в організмі і регуляції інтенсивності метаболізму при патології.
Типи інгібування. Розрізняють оборотне і необоротне відзначено зниження-вання. якщо інгібітор викликає стійкі зміни просторової третинної структури молекули ферменту або модифікацію функціональних груп ферменту , То такий тип інгібування називається необоротним. Найчастіше, однак, має місце оборотне інгібування, піддається кількісному вивченню на основі рівняння Міхаеліса-Ментен. Оборотне інгібування в свою чергу поділяють на конкурентну і неконкурентное в залежності від того, вдається чи не вдається подолати гальмування ферментативної реакції шляхом збільшення концентрації субстрату .
Конкурентне інгібування може бути викликано речовинами , Що мають структуру, схожу на структуру субстрату , Але кілька відрізняється від структури істинного субстрату . Таке інгібування засноване на зв'язуванні інгібітора з субстратсвязивающім (активним) центром. Класичним прикладом подібного типу інгібування є гальмування сукцинатдегідрогенази (СДГ) малоновою кислотою . цей фермент каталізує окислення шляхом дегідрірованія янтарної кислоти ( сукцината ) В фумаровую:
Якщо в середу додати малонат ( інгібітор ), То в результаті структурної схожості його з істинним субстратом сукцинатом (Наявність двох таких же іонізованих карбоксильних груп ) Він буде взаємодіяти з активним центром з утворенням фермент-інгібіторного комплексу, однак при цьому повністю виключається перенесення атома водню від малоната. структури субстрату ( сукцинат ) і інгібітора (Малонат) все ж не однакові. Тому вони конкурують за зв'язування з активним центром , І ступінь гальмування буде визначатися співвідношенням концентрацій малоната і сукцината , А не абсолютною концентрацією інгібітора . Таким чином, інгібітор може оборотно зв'язуватися з ферментом , Утворюючи фермент-інгібіторний комплекс. Цей тип інгібі-вання іноді називають інгібуванням за типом метаболічного антагонізму (Рис. 4.20).
У загальній формі реакція взаємодії інгібітора з ферментом може бути представлена наступним рівнянням:
Утворився комплекс, званий фермент-інгібіторних комплексом ЕI, на відміну від фермент-субстратного комплексу ES не розпадається з утворенням продуктів реакції . константу дисоціації комплексу EI, або ингибиторную константу Ki, можна, дотримуючись теорії Міхаеліса-Мен-тен, визначити як відношення констант зворотного і прямий реакцій :
тобто інгібіторна константа прямо пропорційна добутку концентрації ферменту і інгібітора і обернено пропорційна концентрації комплексу EI.
Метод конкурентного гальмування знайшов широке застосування в медичній практиці. Відомо, наприклад, що для лікування деяких інфекційних захворювань, що викликаються бактеріями, застосовують сульфаніламідні препарати . Виявилося, що ці препарати мають структурну схожість з парааминобензойной кислотою , Яку бактеріальна клітина використовує для синтезу фолієвої кислоти , Яка є складовою частиною
Мал. 4.20. дія конкурентного інгібітора (Схема по В.Л. Кретович). Е - фермент ; S - субстрат ; Р1 і Р2 - продукти реакції ; I - інгібітор .
ферментів бактерій. Завдяки цьому структурному схожості сульфаніламід блокує дію ферменту шляхом витіснення параамінобензой-ної кислоти з комплексу з ферментом , які синтезують фолієву кислоту , Що веде до гальмування зростання бактерій.
деякі аналоги вітамін А В6 і фолієвої кислоти , Зокрема дезоксіпірідоксін і аміноптерин (див. Розділ 7), діють як конкурентні, так звані коферментниє, інгібітори (або антивітаміни ), Які гальмують багато інтенсивно протікають при патології біологічні процеси в організмі . Застосування подібних аналогів в медичній практиці (зокрема, в дерматології і онкології) засновано на конкурентному витісненні коферментів з субстратсвязивающіх центрів ключових ферментів обміну.
Неконкурентное інгібування викликається речовинами , Що не мають структурного подібності з субстратами і часто зв'язуються ні з активним центром , А в іншому місці молекули ферменту . Ступінь гальмування в багатьох випадках визначається тривалістю дії інгібітора на фермент . При даному типі інгібування завдяки освіті стабільної ковалентного зв'язку фермент часто піддається повної інактивації, і тоді гальмування стає незворотнім. Прикладом необоротного інгібування є дія йодацетата, ДФФ , А також діетил-n-нітрофенілфосфата і солей синильної кислоти . Ця дія полягає в зв'язуванні і виключенні функціональних груп або іонів металів і молекулі ферменту .
Слід зазначити, що неконкурентное інгібування також може бути оборотним і необоротним, оскільки відсутня конкуренція між субстратом і інгібітором за активний центр . Приклади незворотного інгібування наведені раніше. При оборотному неконкурентном ингибировании субстрат S і інгібітор I зв'язуються з різними центрами, тому з'являється можливість утворення як комплексу EI, так і потрійного комплексу EIS; останній може розпадатися із звільненням продукту, але з меншою швидкістю, ніж комплекс ES.
Цей тип неконкурентного інгібування найчастіше спостерігається у ферментів , Які каталізують перетворення більш одного субстрату , Коли зв'язування інгібітора не блокує зв'язування субстрату з активним центром . інгібітор при цьому з'єднується як з вільним ферментом , Так і з ES-комплексом.
Відомо, крім того, так зване безконкурентному інгібі-вання, коли інгібітор зв'язується з ферментом також в некаталітичні центрі, проте не з вільним ферментом , А тільки з ES-комплексом у вигляді потрійного комплексу.
Для з'ясування питання про тип інгібування користуються рівняннями Міхаеліса-Ментен, Лайнуівера-Берка або іншими, наприклад рівнянням Еді-Хофсті:
ν = -Km (y / [S]) + Vmax
і відповідними графіками в прямолінійних координатах.
РНС. 4.21. Графіки залежності швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату в присутності конкурентного інгібітора .
а - в координатах v від [S]; б - в координатах 1 / v від 1 / [S]; Vmaxі Vi - максимальні швидкості реакції ; Кm і Kmi - константа Міхаеліса відповідно за відсутності (1) і в присутності (2) інгібітора .
Мал. 4.22. Графіки залежності швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату в присутності неконкурентного інгібітора . Позначення ті ж, що на рис. 4.21.
При конкурентному типі інгібування інгібітор збільшує значення Кm, не впливаючи на максимальну швидкість Vmax (рис. 4.21). Це означає, що при досить високій концентрації субстрату [S] інгібітор витісняється молекулами субстрату з комплексу EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 4.22) інгібітор знижує величину максимальної швидкості. Якщо при цьому величина Кm не зменшується, то говорять про повністю неконкурентном ингибировании. Подібний тип відзначено зниження-вання має місце при утворенні неактивних, труднодіссоціірующіх комплексів EI і (або) EIS. Часто, однак, спостерігається змішаний тип інгібування, іноді званий частково неконкурентним, або оборотним неконкурентним пригніченням (див. Раніше), при якому зниження Vmaxсочетается з одночасним збільшенням значень Кm. Це означає, що комплекс EI зберігає часткову активність , Тобто здатність до утворення проміжного потрійного комплексу EIS, в якому субстрат піддається сповільненого каталітичного перетворення. У рідкісних випадках ступінь гальмування активності ферменту може збільшуватися з підвищенням концентрації субстрату . Для цього типу гальмування був запропонований, як зазначено раніше, досить неточний термін «безконкурентному інгібування». Один з механізмів такого гальмування обумовлений можливістю з'єднання інгібітора з комплексом ES з утворенням неактивного або повільно реагує потрійного комплексу EIS.
Таким чином, при графічному аналізі швидкостей ферментативних реакцій як функції концентрацій субстрату може бути отримана цінна інформація не тільки про кінетики ферментативних реакцій , А й про молекулярні механізми ферментативного каталізу .
Попередня сторінка | Наступна сторінка
ЗМІСТ
