Резекція печінки і аутологічної трансплантації схематично представлені на малюнку 1. Представник когорти 5 свиней, які зазнали резекції печінки, більшість було врожайності> 1 х 109 гепатоцитів з приблизно 80% життєздатність (Таблиця 2), забезпечуючи велику кількість клітин для будь-якого типу бажаного маніпуляції, в тому числі ген терапії. Наступні культури-пересаджені частина підготовлених гепатоцитів з кожного з цих 5 свиней показав хороші життєздатність і адгезії, з типовою гепатоцитів морфологія 46 годин після трансдукция і початкового покриття (рис. 2). Ці результати є представник по успішної підготовки, в той час як погані результати будуть вказуватися з низькою кількістю клітин, життєздатність або мінімальне дотримання в монослое клітин.
Біопсія печінки до лікування фа - / - свині показує вираження не FAH через імуногістохімія (рис. 3). Початковий приживлення буде залежати від кількості клітин, знову під час пересадки. Трансдукція частоти свинину гепатоцитів в пробірці за допомогою людини в MOI 10 ту / гепатоцитів - зазвичай 70-100%. Прижилися клітини клонально буде розширюватися в фа - / - печінки, до тих пір, поки весь печінки заповнений виправлені клітинами. Представник біопсій на 2, 6 і 12 місяців демонструють Хронологія фа позитивних клітин розширення, який зазвичай завершується через 12 місяців після трансплантації (рис. 3). Навіть низький відсоток приживлення очікується в кінцевому підсумку населити печінки, хоча фактичний початковий приживлення ставки не були оцінені в цьому експерименті.
Свині є ретельно контрольованих після трансплантації для збільшення ваги, як відмова процвітати є ознакою, що мало виправити гепатоцитів присутні. У цьому випадку тварини є циклічно назад на NTBC при необхідності до виправленнями гепатоцитів населення є достатнім для повного відлучення від наркотиків. Оцінки поширення біомаркерів забезпечує легкий доступ до слідувати терапії. Як тільки тварина досягла близько 20% заселення виправлені гепатоцитів в печінці, тирозин і succinylacetone рівнях нормалізується в порівнянні з здичавів тип тварин (рис. 4A). Крім того під очищених або неочищених фа - / - свиня демонструє аналогічні фіброзних змін печінки, бачили в постраждалих людей, які можуть супроводжуватися Masson trichrome фарбування серійний біопсій8. Сурогатних маркерів поточної травми печінки можуть бути оцінені випробування циркулюючих печінкових ферментів, таких як аспартатамінотрансфераза і лужної фосфатази. У той час як непоправний тварин показують значне підвищення в обох параметрів, в порівнянні з дикого типу тварин, ex vivo генної терапії повертає ці цінності сироватці нормальний (рис. 4B і 4 C). Нарешті загального здоров'я печінки метаболізм порушується в необробленої фа - / - свині, як зазначено на фасади в циркулюючих аміаку. Заселення печінки з виправлені клітинами відновлює здичавів тип рівнів аміаку (рис. 4 d).
Малюнок 1: гепатектоміі і аутологічної трансплантації. (За годинниковою стрілкою зверху) Часткову резекцію печінки проводиться з цього питання є джерелом гепатоцитів і стимулювання регенерації печінки. Гепатоцити ізольовані від резекції печінки (сині клітини), transduced ex vivo з лентівірусние вектор, що містить трансгени інтерес (коричневі клітини), а потім transduced клітини autologously пересаджені назад в джерело тварин через ін'єкції ворітної вени. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 2: первинний свиня гепатоцитів з печінки секцій. Гепатоцитів були культивовані від резекції печінки з 5 різних свиней, перетворені з лентівірусние вектор і дозволено рости протягом 48 годин для демонстрації морфології, життєздатність, чистоти і адгезії до культури страви. Ці в vitro якісні оцінки служать індикаторами сурогату для ймовірність успішного приживлення в природних умовах для кожного приготування. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 3: Виправлена гепатоцитів населити фа - / - свиня печінки. Фа імуногістохімія з біопсії печінки, 0, 2, 6 і 12 місяців після ex vivo генної терапії аутологічної гепатоцитів. Лікувати фа- / - шоу свиней не фа позитивних клітин в печінці (A). Через два місяці після пересадки (B), окремих вогнищ FAH позитивні гепатоцитів видно, які потім проходять розширення для заміни 50 - 60% печінки на 6 місяців (C), після чого повна заміна, бачили на 12 місяців (D). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 4: Біохімія сироватки на 10 місяців пост ex vivo генної терапії в фа - / - свиней. 10 місяців після терапії, тирозин, аспартат (АЛТ) 14, лужноїфосфатази (ALP) і рівнів аміаку значно нижче, ніж необроблених FAH недосконалим тварин і відрізняються від дикого типу рівнів. Дані були проаналізовані на значення за допомогою тесту Mann-Whitney U (значення, представлені p). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
77 3 1 213 995 82 4 789 671 85 5 1318 975 74 Середнє 1140 914 80 ST-Dev 244 194 5
Таблиця 2: Представник гепатоцитів результати від звичайної ізоляції від 5 свиней.
