Наукові відкриття, удостоєні цього року премії з хімії, стали можливі завдяки еволюційному підходу до хімії біомолекул.
Зліва направо: Френсіс Арнольд, Джордж Сміт, Грегорі Вінтер.
Метод штучної еволюції ферментів: 1 - в ДНК ферменту вносять випадкові мутації і мутантних ДНК вводять в бактерії; 2 - бактерії напрацьовують молекули ферментів з різними мутаціями; 3 - аналіз мутантних ферментів на ефективність; 4 - повторення циклу.
Метод фагового дисплея: в ДНК фага вбудовують ген, і в результаті в оболонці частки фага з'являються сторонні білкові молекули, закодовані у вбудованому гені. За ці білки можна фагів частинки можна виловити за допомогою антитіл.
<
>
Нинішню Нобелівську премію з хімії хочеться назвати однією з найбільш біологічних - бо над усіма трьома лауреатами в буквальному сенсі віє дух Дарвіна. Френсіс Арнольд (Frances H. Arnold) з Каліфорнійського технологічного інституту отримала половину премії за метод спрямованої еволюції ферментів; Джордж Сміт (George P. Smith) з Миссурийского університету і Грегорі Вінтер (Gregory P. Winter) з Кембриджа разом розділили іншу половину премії за метод фагового дисплея в відборі пептидів і антитіл - в обох випадках мова йде про використання в хімії еволюційних механізмів. Ми звикли думати, що еволюція стосується тільки слонів, мишей, бактерій, пшениці і т. Д., Проте одні з головних принципів еволюційного розвитку, мінливість і відбір, цілком працюють і на рівні біомолекул.
Як ми знаємо, ферменти - це великі (іноді дуже великі) білкові молекули, які виконують ті чи інші хімічні реакції, які виконують дуже швидко і дуже ефективно. Думка використовувати ферменти для того, щоб вони створювали нам нові матеріали і речовини, з'явилася в науковому світі досить давно. Однак білки працюють тільки в умовах живого організму, тобто в водному розчині певної температури, певною концентрацією солей, рівнем рН і т. Д. Крім того, всі ферменти виконують тільки свої реакції: вони розщеплюють, з'єднують, перетворюють лише ті молекули, на яких вони спеціалізуються. Припустимо, ми хочемо, щоб якийсь фермент став розщеплювати якась речовина, з яким він раніше справи не мав; більш того, бажано, щоб реакція йшла не в воді, а, наприклад, в органічному розчиннику. що потрібно для цього зробити?
Для цього потрібно змінити структуру ферменту. Як і всякий білок, він являє собою складно скручену ланцюг з амінокислот. Послідовність амінокислот визначає, чим і як займається білкова молекула. Здавалося б, чого простіше: властивості амінокислот давно відомі, їх взаємини в поліпептидного ланцюга теж можна прорахувати, значить, вся справа лише в тому, щоб в ферменті переставити або замінити деякі амінокислоти іншими. Однак це легше сказати, ніж зробити. Ферменти складаються з сотень і тисяч амінокислот, і навіть зараз, із застосуванням потужних обчислювальних алгоритмів, не завжди можна точно сказати, як та чи інша аминокислотная заміна вплине на просторову структуру і функції білка.
Тому Френсіс Арнольд, спочатку навчилася на аерокосмічного інженера-механіка і згодом переключився на початку 80-х років на ферменти, вирішила в прямому сенсі покластися на природу. Арнольд експериментувала з ферментом субтилизина, який розщеплює молочний білок казеїн - ідея була змусити субтілізін працювати не в воді, а в органічному розчиннику диметилформамиде. У той час білки вже можна було вирощувати в бактеріях, потрібно було тільки методами генетичної інженерії забезпечити бактерію геном необхідного білка. Арнольд і її колеги вносили в ген субтилизина випадкові мутації і вводили мутантні гени в бактерію. Потім отримані білки перевіряли в 35-процентному розчині диметилформаміду. З мутантних білків хтось працював в диметилформаміді краще, хтось гірше, і для наступного етапу відбирали тих, хто працював краще - в них вносили нову порцію мутацій, і все повторювалося.
По суті, все відбувалося так само, як і при звичайній еволюції: в групі мишей з'являються випадкові мутації, які в деяких випадках допомагають мишам виживати при тих чи інших умовах, і коли ці самі умови настають, перевага в популяції отримують конкретні особи. Тільки у випадку з ферментом умови ставив експериментатор, він же вносив зміни в білок і він же оббирав найбільш вдалі варіанти.
Через три «покоління» субтилизина дослідники отримали варіант ферменту, який працював в диметилформаміді в 256 разів ефективніше, ніж вихідний білок. У цьому надефективні субтилизина виявилося десять мутацій, які повинні були опинитися в ньому саме все разом - поодинці у мутацій нічого б не вийшло.
Таким був перший крок; другий зробив голландський дослідник Віллем Штеммер (Willem PC Stemmer), який теж міг би отримати свою частину премії, якби не помер в 2013 році. Він ввів в штучну еволюцію ферментів ще один природний процес - перетасування фрагментів ДНК між генами. У нас така перетасування відбувається при формуванні статевих клітин: різні варіанти одного і того ж гена, обмінюючись власними фрагментами, отримують один від одного ті чи інші мутації, таким чином підвищується мінливість білків, і серед них з'являються такі, які об'єднують в собі разу кілька мутаційних «плюсів». Штеммер організував те ж саме при відборі ферментів: в пробірці плавало безліч шматків ДНК, що відносяться до одного і того ж білку, і ці шматки за допомогою спеціальних ферментів постійно з'єднувалися один з одним. Потім отримані химерні гени відправляли в бактерії і потім порівнювали варіанти готових білків.
У міру розвитку методів генетичної інженерії удосконалювалася і лабораторна еволюція ферментів. Френсіс Арнольд продовжувала працювати в цій галузі, і зараз на рахунку її лабораторії вже маса білків, що виконують найрізноманітніші хімічні реакції, які не зустрічаються в природі, але без яких не може обійтися, наприклад, фармацевтична промисловість і інші (біо) хімічні галузі.
Історія другої половини премії - за фагів дисплей - теж бере початок у першій половині 80-х років. У той час про білках знали більше, ніж про генах; на руках у дослідників було багато відомих білкових молекул, але ніхто не знав, в якому місці геному вони закодовані. Джордж Сміт запропонував використовувати для пошуку генів бактеріальних вірусів, або бактеріофагів (або просто фагів). Фаги, як і будь-які інші віруси, проникають в клітку і змушують її копіювати власний фагів геном і синтезувати фагів білки. Ідея Сміта полягала в тому, щоб в ДНК вірусу вставити невідому ДНК (на той момент на руках у дослідників були цілі бібліотеки ДНК з різних геномів, тільки ніхто не знав, що в них закодовано).
В результаті в фаговой ДНК наш білок буде закодований поруч з фагів білком - найкраще поруч з тим, який утворює білкову оболонку вірусу (капсид). І коли вірусна частка збереться, в оболонці вірусу буде стирчати і наш білок. Так можна отримати цілий набір вірусних частинок з різними сторонніми білками. Притому ми пам'ятаємо, що початково ми шукаємо ДНК до відомого білку. На фагових частинках буде сидіти безліч різних білків, синтезованих на різних фрагментах з нерозшифрованої бібліотеки. Як ми можемо зловити вірусні частинки, в які потрапила ДНК саме з нашим відомим білком? За допомогою антитіл. За антитіла до білку ми витягнемо з фагового супу ті частинки, в яких є наш білок і його ДНК, потім прочитаємо геном фага з тієї вставкою, яку ми самі в нього вставили - і так дізнаємося потрібний ген.
Так з'явився метод фагового дисплея. Про нього скоро стало ясно, що у нього є і маса інших додатків, крім як пошук відповідностей між білками і генами. Грегорі Вінтер, наш третій лауреат, пристосував цей метод для відбору антитіл. Імунітет, як відомо, виробляє величезну кількість антитіл-імуноглобулінів - величезна як в сенсі кількості, так і в сенсі різноманітності. В його асортименті завжди знайдеться антитіло, яке зможе зв'язатися з будь-якої досі невідомої бактеріальної або вірусної молекулою і повідомити організму про небезпеку. Медики і біотехнологи давно хотіли використовувати імуноглобуліни зважаючи на їх чудових здібностей дуже специфічно і дуже міцно зв'язувати тільки конкретні молекули і не звертати уваги ні на які інші. Спочатку антитіла для дослідницьких потреб отримували, вводячи лабораторним мишам певні молекули (наприклад, білки ракових клітин), і організм тварин напрацьовував потрібні імуноглобуліни. Але таким способом можна було далеко не завжди отримати антитіла в необхідних кількостях; крім того, мишачі білки, якщо їх вводили людям, обурювали людський імунітет.
Вінтер ввів в геном фага шматок ДНК, що кодує людський імуноглобулін - причому той шматок, який кодує «хапальну» частина білка (тобто ту, яка безпосередньо розпізнає іншу молекулу). Це була ідея з фагового дисплея - ввести в вірус потрібний білок. Тільки тепер на поверхні вірусу сидів фрагмент антитіла. Такий вірус можна було виловити з безлічі інших як раз за допомогою тієї молекули, з якої мало зв'язуватися антитіло. Але серед імуноглобулінів є більш ефективні і менш ефективні - ті, які взаємодіють зі «своєї» молекулою міцніше і більш специфічно, і ті, які взаємодіють з нею гірше. І тут в справу знову вступають еволюційні методи: Вінтер і його колеги вбудовували в фагів ДНК безліч різних варіантів ДНК антитіл. Всі варіанти були проти однієї і тієї ж молекули, але у всіх неминуче була різна ефективність. Потім починався відбір: фагів виловлювали, аналізували, які варіанти ДНК кодують найбільш ефективні антитіла, і потім в ці варіанти вносили нові мутації. Процедура повторювалася, і на наступному етапі відбирали тих мутантів, які виявилися ще більш ефективними. Причому все це було людські білки - адже в фаг вставляли фрагмент людського гена.
Відбір антитіл за допомогою фагового дисплея швидко знайшов застосування у фармацевтичній промисловості. Сам Вінтер з колегами зробив в 90-і роки людські антитіла, які успішно придушували аутоімунні процеси; препарат на основі цих антитіл почали використовувати для лікування псоріазу та ревматоїдного артриту. І, природно, потім справа дійшла до імуноглобулінів, які дуже специфічно взаємодіють з білками ракових клітин. (Точніше, мова йде про полегшених версіях імуноглобулінів - такі «фагів-дисплейні» білки представляють собою тільки робочу, що розпізнає частина антитіла.)
Перераховувати всілякі додатки білків, що відбираються за допомогою фагового дисплея, можна довго - як і у випадку з ферментами, які отримують шляхом відбору в пробірці. І практичне, і теоретичне значення нобелівських відкриттів не викликає сумнівів. Однак нам здається важливим ще раз підкреслити, що обидва відкриття трапилися як результат глибокого розуміння еволюційної теорії - яка, як ми бачимо допомагає не просто абстрактно осмислювати світ навколо, але і приносить безпосередні практичні плоди.
за матеріалами Нобелівського комітету .
О потрібно для цього зробити?
