Спонтанне Міогенний активності
Спонтанне миогенной діяльність є важливим гладка характеристика м'яз, яка зазнає змін з постнатального розвитку 6-9 і патології (наприклад, SCI, BOO) 3-5. Тому що ця діяльність, як вважають, сприяють симптомів гіперактивного сечового міхура (OAB) 2, оцінка рецепторів, внутрішньоклітинних шляхів і фармакологічних агентів, які модулюють його, представляє великий інтерес для розробки ефективних методів лікування автономної адресної книги та інших порушень гладкої мускулатури. Метод, представлений тут може легко досліджувати ці питання Малюнок 2 ілюструє різні зразки миогенной спонтанної активності в процесі розробки в неонатальному (I), неповнолітніх (II) для дорослих (III) і пошкодженням спинного мозку щура. (SCI; IV). Смуги з новонароджених щурів демонструють велику амплітуду, низькочастотні ритмічні скорочення (Малюнок 2AI), в той час як смуги з дорослих Крис виставляти малу амплітуду, високу частоту діяльність (Малюнок 2aii, III). Після ТСМ новонароджених картина знову виникає (Малюнок 2Aiv). На додаток до використання смуги з тварин моделей, різні фармакологічні агенти можуть бути використані, щоб викликати спонтанні скорочення у вигляді смуг з наївних тварин, з метою розуміння механізмів, що лежать в основі спонтанних скорочень. Приклади відповідних фармакологічних агентів включають агоністи мускаринових рецепторів (Carbachol; ЦХ)., З'єднання, які збільшують рівень ACh (наприклад, інгібітори ацетилхолінестерази), низькі концентрації KCl (наприклад, 20 мм) або інших експериментальних препаратів Фігури 3A-B, ілюструють модуляції спонтанної активності за допомогою фармакологічних агентів, які діють на KCNQ каналів, розташованих на гладкі м'язи. Канал ніж KCNQ, флупіртін, зменшує амплітуду і частоту спонтанної активності в залежності від концентрації (Малюнок 3AI-III), в той час какKCNQ каналу блокатор, XE991, зменшує амплітуду, але збільшує частоту спонтанної активності (Малюнок 3Bi-III).
Гладка м'язовий тонус
Властивості Гладка м'язового тонусу і скоротливої є важливими факторами для правильного функціонування сечового міхура під час зберігання і сечовипускання. Цей метод може легко екранувати дію фармакологічних агентів на тонус гладких м'язів. Малюнки 3Aiv і 3Biv показують, що флупіртін зменшується базальний тонус, відповідно до релаксації гладкої мускулатури, в той час як XE991 збільшується гладкою м'язового тонусу. Малюнок 4 ілюструє залежності від концентрації збільшення тонусу гладких м'язів шляхом активації рецепторів бомбезіна з нейромедін B (NMB; фіг.4, В) або мускаринові рецептори з карбахола (CCH; Фігури 4C, D). Крім того, внутрішньоклітинні шляхи посередницькі ці гладкі відповідей м'язів можуть бути досліджені Uпеть конкретні модуляторів (дані не показані).
ЦНС-опосередковані Відповіді і модуляція нейротрансмісію
Скорочення сечового міхура досягається випуском АХ / АТФ з парасимпатичних еферентних нервів. Внесок мускаринових і пуринергічні систем для скорочення сечового міхура коливається у різних видів і патологічних станів, з переважним збільшенням пуринергічні внесок в патологій, таких як інтерстиціальний цистит, часткової обструкції, і гіперактивного сечового міхура 26. 5С демонструє використання цього методу для визначення внесок мускаринових і пуринергічні компонентів нейропередачі сечового міхура смуг від миші. Внесок холінергічної компонента оцінювали за допомогою антагоніст мускаринових рецепторів ,, атропін. Внесок пуринергічні системи оцінювали за допомогою пуринергічні активатор рецептора і десенсибілізаторів, альфа, бета-метилен АТП (ABMA). Крім того, залежить від частоти внесок кожного компонента оцінювалася шляхом зміни частоти стимуляції від низької до високих частот (2-50 Гц).
Сила стиснення сечового міхура грає важливу роль в сечовипускання ефективно. Використовуючи цей метод, рецептори та шляхи, які модулюють нейронної передачі можуть бути досліджені як лікарських препаратів для сечовипускання дисфункції. В рецептори 5НТ4 виражені попередньо junctionally в парасимпатичних нейронів і їх активація підвищує рівень ACh 27. Малюнок 6 ілюструє збудливу дію агоніста рецептора 5НТ4, цизаприд, в сечовому міхурі і клубової кишки людини смуг.
Різні експериментальні протоколи можуть бути використані для визначення місця дії випробуваного з'єднання. Діаграма на малюнку 7А ілюструє протокол, який використовується для оцінки PRE- проти пост-функціональні ділянки. Якщо препарат X зменшує (або збільшується) відповідь EFS, але не має ефект на відповідь ККЗ, швидше за все, місцем дії є пресинаптические. Якщо препарат X змінює як EFS і CCh відповіді, то він може діяти на рецептори, розташовані після junctionally або як до, так і після junctionally.
Роль кожного компонента: гладких м'язів, слизової оболонки, і нейронів
Різні патологічні стани можуть впливати на різні компоненти в сечовий міхур. Наприклад інтерстиціальний цистит (IC) впливає, перш за все, уротелій, в той час як автономної адресної книги може привести до зміненої скоротливості гладких м'язів. Крім того, різні рецептори можуть бути виражені в кожному компоненті сечового міхура і, таким чином, можуть бути спеціально спрямована в певному патології. На відміну від природних умовах методів в, які вимірюють чисту вплив всіх компонентів сечового міхура, цей метод в пробірці дозволяє досліджувати окремих компонентів за допомогою комбінації хірургічних і фармакологічних. Щоб перевірити гладких м'язів стиснення / релаксації під час відсутності нейроновпередачі, ТТХ (0,5-1 мкм) може бути доданий в ванну. На малюнку 4, і NMB ЦХ були випробувані в присутності ТТХ. Щоб перевірити внесок в слизовій оболонці (уротеліі і власної пластинки) в скоротливості гладких м'язів, смуги з і без шару слизової оболонки порівнюються. 7В показує, що у відповідь на ЦХ зменшується в присутності слизової оболонки свині в 28. Аналогічні результати були отримані в людини смуг міхура 29. Щоб перевірити роль нервових волокон, кілька підходів можуть бути прийняті. Одним з них є, щоб активувати або пригнічувати певні волокна за допомогою фармакологічних агентів. Наприклад, капсаїцин активує особливий населення аферентних нервів і викликає видів, що залежать скорочення гладких м'язів або релаксації 17,18. Гуанетидин уповільнює вивільнення норадреналіну з симпатичних волокон, тим самим усуваючи внесок цих волокон. Інший підхід полягає в ДЕСЕНСИБІЛІЗОВАНИЙ / виключити конкретні волокна в природних умовах до експерименту. Наприклад, системне лікування тварини з капсаїцин зменшує чутливість капсаїцин чутливих аферентних нервів. Інші компоненти міхура, які можуть бути вивчені в даному препараті є інтерстиціальні клітини або щілинні контакти по активації або блокування їх з конкретними агентами.
видові відмінності
Хоча більшість розробка Препарат призначений для лікування захворювань у людини і фундаментальних досліджень, перш за все, виконується в тканини тварини. Існують Видові відмінності в ряді рецепторів. Наприклад, агоністи 5НТ4 рецепторів підвищення нервову, викликали скорочення в сечовому міхурі людини, але не в сечовий міхур щурів 19,30, EFS-індукованої сутички майже виключно атропін чутливих в людській і старого світу мавпи детрузора від стабільних бульбашок 31, але стати частково атропін стійкістю в людській детрузора у пацієнтів з нестабільними умовами сечового міхура (наприклад, нейрогенного, obstructeд бульбашки) 15,32,33, капсаїцин викликає збудливий відповідь в щурячих і сечового міхура людини смуг, ні відповідь в свиню мо чевого міхура смуг і ингибиторной відповідь в морської свинки сечового міхура смуг 17,18. 4 видно, що бомбезин агоністи мають збуджуючі ефекти на щур сечового міхура і не вплив на мишей і свиней сечового міхура смуг 16. Ця інформація має вирішальне значення для вибору відповідного тваринну модель для вивчення специфічний рецептор.
Порівняння чутливості через органів
Препарати, призначені для лікування порушень сечового міхура може також впливати на гладку мускулатуру від інших органів, таких як шлунково-кишкового тракту, сечівника, жовчного міхура і т.д. Цей метод дозволяє оцінити органів селективність і чутливістю до фармакологічних агентом шляхом порівняння різних тканин пліч-о-пліч. Як показано на малюнку 6, агоніста 5НТ4, цизаприду, вже отлічаютсяЛОР ефективність і потенції в сечовому міхурі людини проти клубової тканини.
Рис.1 Експериментальна установка і смуги сечового міхура підготовка.) Схема експериментальної установки. Сечового міхура смужки занурюють в тканини камер, заповнених пористого розчином Кребса витримували при 37 ° C за допомогою водяного насоса, що циркулює. Один кінець смуги прикріплена до датчика изометрического сили для вимірювання тканин скоротність, а інший з фіксованим стрижнем. Перетворювач сили з'єднаний з підсилювачем і комп'ютер для запису даних. Стимуляції електроди електричного поля, підключені до стимулятора поміщають в камеру і використовується для викликаючи ЦНС-опосередковані скорочень сечового міхура. Б) Отримання тканин смуг. Сечовий міхур придавлений в блюдо і наступні процедури виконуються: # 1 вертикальний розріз гоух вентральної половини сечового міхура з уретри на купол, щоб відкрити сечовий міхур в плоский лист. # 2 горизонтальні розрізи видалення купол і основа сечового міхура / проксимального сечівника. . # 3 вертикальні розрізи, що ділять середині міхур на рівні смужки (4 смуги від щурів сечового міхура) C) Схема компонентів смуги: гладкі м'язи і слизова оболонка, обидва містять аферентні (синій) і еферентні (зелений) нерви. Слизова оболонка складається з уротеліі і власної пластинки. Власна пластинка містить кровоносні судини [1], інтерстиціальні клітини [2], і м'язової слизової [3]. Пунктирна лінія, позначена # 2b показує процедуру для видалення слизової шар. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 2. міогенних спонтанної активності в процесі розробки і після патологія.) Приклади спонтанної активності в неонатальному (I), щодо неповнолітніх (II), спинного недоторканими дорослих (III) і пошкодженням спинного мозку (SCI) для дорослих (IV) смужки щурів сечового міхура. SCI щура використовували протягом 4 тижнів після операції. B, C) Резюме амплітуди (В) і частот (С) спонтанних скорочень в чотирьох групах досліджуваних. (Відтворюється з дозволу Artim DE, Кульман FA, Догерті SL, Bupp Е, Едвардс CL, де Крупи туалетом Neurourol Urodyn 2011 Ноя; 30 (8): .. 1666-74.) Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цього фігура.
Малюнок 3 Модуляція миогенной спонтанної активності і тонусу гладких м'язів.) Ефект каналу ніж KCNQ, flupirtine, на спонтанної активності і базового тону у дорослих смуг щур сечового міхура. (Я) Флюпіртін був доданий в зростаючих концентраціях (наростаючим підсумком) за часів, позначених стрілками. Розширення під трасування шоу 4 хв смуги діяльності протягом контролю і після застосування 10 мкм і 50 мкм флупіртіна. (II-IV) Короткий опис ефектів флюпіртіна (7 смужки з 4 щурів) від амплітуди (II) і частоту (III) спонтанної активності і базового тону (IV), виражене в% від зміни управління (попередньо наркотиків) значень, які були встановлені на 100%. B) Ефект від каналу блокатор KCNQ, XE991, на спонтанної активності і базового тону у дорослих смуг щур сечового міхура. (Я) XE991 був доданий в зростаючих концентраціях (наростаючим підсумком) за часів, позначених стрілками. Розширення під сліду показати 2 хв від смуги діяльності при постійному контролі й після застосування 10 мкм і 50 мкм XE991. (II-IV) Резюме наслідків XE991 (9 смуги з 4 щурів) наАмплітуда (II) і частота (III) спонтанної активності і базового тону (IV), виражені в% зміни від управління (попередньо наркотиків) значень, які були встановлені до 100 %. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 4 Види відмінності.) Залежним від концентрації скорочень гладкої мускулатури у відповідь на агоніст рецептора бомбезіна, нейромедіна B (NMB), в стрічках щурів сечового міхура. B) Основна ефектів NMB на гладких м'язів в смугах щурів сечового міхура. Дані нормовані на KCl (80 мМ) відповідь. C, D) Відсутність відповідей на НМБ в миші (C) і свині (D) смуг міхура. Carbachol (ССН) викликає сильне залежне від концентрації конТягі в обох миші і свині смуг, що вказує, що смуги може реагувати на подразники. ТТХ (0,5 мкм) був присутній у ванні у всіх смуг. (Відтворюється з дозволу Kullmann FA, McKenna D, Wells Г.І., Тор КБ нейропептидів 2013 жовтень; 47 (5): .. 305-13) Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 5 Електростимуляція поле.) Схема окремих параметрів імпульсу стимуляції. Скорочення: D = тривалість імпульсу, я = інтенсивність імпульсу, IPI = між імпульсу інтервал B) Схема параметрів поїзд стимуляції .. Скорочення: тривалість тд = поїзд, я = інтенсивність імпульсу, ити = серед інтервал поїзд. На врізки показано кількість імпульсів в поїзді і інтервал Між каналEEN їх, які разом з тривалістю залізничного визначити частоту залізничного стимуляції. C) Внесок purinegic і холінергічних компонентів ЦНС-викликав скорочення сечового міхура. EFS-FR представляють стимуляції частоти, 2, 5, 10, 20, 50 Гц. Три подразники, що поставляються кожні 90 секунд були випробувані на кожній частоті, і кожна серія частоти повторюють двічі в контролі і в два рази після додавання кожного з'єднання. Альфа-, бета-метилен АТФ, скорочено ABMA (смуга 1), був використаний, щоб зменшити чутливість рецепторів пуринергічні і атропін (смуга 2) був використаний для блокування мускаринових рецепторів. Газа 3 служили контролем і обробляли транспортного засобу, води. Стрілки вказують час, коли кожне з'єднання додавали до кожної смуги. Слід зазначити, що EFS-викликаних скорочень сильно знижена на ABMA і атропін, а не залежить від транспортного засобу. ТТХ був доданий в кінці експерименту в той час як EFS була доставлена з частотою 20 Гц. Слід зазначити, що інші скорочень, що спостерігаються в контролеполоса 3 були скасовані ТТХ, демонструючи свою нервову природу (тобто з ініціативи вивільнення трансмітера від очної нервів). # Вказує відповідей гладких м'язів ABMA за відсутності EFS. Шкала барів є 5 хв для осі х і 2 г для осі у. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
Малюнок 6 Модуляція нервову, викликали скорочень сечового міхура. A, B) Приклади підвищення на нервову, викликали скорочень по агоніста 5НТ4 рецепторів, цизаприд в сечовому міхурі людини (A) і клубової кишки смуг (B). Цизаприд (чорні записи) або ДМСО (сірі записи) додавали в залежності від концентрації в моменти часу, зазначені стрілками. Чорні смуги нижче записів в кожній панеліпредставляют EFS, яка складалася з 10 сек поїздів, що поставляються при 20 Гц кожен 120 сек. Вертикальна шкала бари 1 г для всіх прикладів. Концентрація ТТХ було 0,5 мкМ. CF) Резюме площі під кривою (AUC) з EFS-викликаних скорочень у відповідь на цисаприду (чорні смуги) або ДМСО (сірі стовпчики) в сечовому міхурі смуг (C, D) і клубової кишки смуг (E, F). В CF, СО позначає СО-203 186, що являє собою короткий виклад даних, отриманих після додавання антагоніста рецептора 5НТ4. Пунктирні лінії встановлюються на 100% і становлять контроль. (Відтворюється з дозволу Kullmann FA, Kurihara R, Е. L, Wells Г.І., McKenna Д.Г., Бургард ЄС, Тор KB Auton Neurosci 2013 Jun; 176 (1-2): ... 70-7) Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшене малюнку.
Fi фігура 7. Сайти дією наркотиків і ролі різних компонентів сечового міхура.) Схема протоколу для ідентифікації місця дії препарату. Смуги стимулюють ESF і карбахола (ККЗ). У I наркотиків X зменшує реакцію EFS, але не відповідь CCh, що вказує на пресинаптичні місці дії. У II, препарат X змінює обидва відповідей, вказуючи дію на постсинаптичних або обидва до і після сполучних рецепторів. B) Вплив слизової на скорочення гладких м'язів. Ефекти карбахола зменшуються в смугах зі слизової даний час (неушкоджену) в порівнянні з смужками з слизової видалені (оголені). (B відтворюється з дозволу Глід MH, Chapple CR, Cock M, шахи-Williams R. Br J Pharmacol 2000 лютий; 129 (3) :. 416-9). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.
