Унікальні гени | Журнал Популярна Механіка

1. Скільки треба клітин?
2. відмивання ДНК
3. Користь від мовчання
4. конструктивний бульйон
5. Гонки в поле
6. без свідків

Коли в XIX столітті було з'ясовано, що папілярний візерунок на подушечках пальців унікальний для кожного індивіда, дактилоскопія революционизировала криміналістику. Залишив відбиток на місці злочину - НЕ відкрутишся. Злочинці озброїлися рукавичками і серветками для стирання «пальчиків». Але їм стало набагато складніше, коли було зроблено нове відкриття: наш індивідуальний «паспорт» зберігається в кожної зі ста трильйонів клітин людського тіла.

Так, мова йде про ДНК і молекулярно-генетичної експертизи. Все начебто просто: береться ДНК з клітин, залишених злочинцем, і порівнюється з ДНК з клітин підозрюваного. Насправді, звичайно, простота тут удавана. Якщо деякі живі клітини можна розглядати в слабенький шкільний мікроскоп, а то і неозброєним оком (приклад - яйце), то ДНК - об'єкт мікросвіту, і так просто «взяти» її не вийде. Те ж зі «порівнянням». ДНК людини становлять 3,1 млрд пар основ. Прочитання (секвенування) всього цього обсягу інформації - завдання вкрай трудомістка.

Скільки треба клітин?

Про те, як складається унікальний генетичний портрет людини і які технології при цьому застосовуються, ми поговорили з представниками компанії Gordiz - єдиного в Росії виробника реагентів для проведення генетичних судово-медичних експертиз. Для початку хотілося дізнатися, який мінімум біологічного матеріалу повинен залишити злочинець на місці злочину, щоб молекулярно-генетичний аналіз став можливий.

Схема полімеразної ланцюгової реакції показує основні етапи багаторазового копіювання цікавить ділянки ДНК (маркера). На етапі денатурації під впливом нагріву ланцюжок ДНК розпадається на дві нитки. На етапі відпалу при охолодженні до окремих ниток ДНК приєднуються мітки-праймери. На етапі елонгації фермент полімераза добудовує другу нитку досліджуваній ділянці.

«Можна в принципі отримати результат з однієї клітини, - говорить фахівець компанії Сергій Леонов, лікар-біохімік, кілька років пропрацював судмедекспертом. - Є, наприклад, прилади - лазерні мікродіссектори, які дозволяють вирізати з досліджуваних зразків поодинокі клітини. Однак робота з таким малим кількістю генетичного матеріалу не відноситься до стандартних технологій і процесів і не гарантує високу надійність. Для нормального процесу потрібно як мінімум 10-15 клітин, і насправді це дуже маленька кількість. Один дотик рукою до предмету залишає на ньому сотні клітин ».

Так, людина щедро розкидається генетичним матеріалом, але вже на етапі пошуку біологічних слідів злочинця судмедекспертів чекає багато проблем. Наприклад, відмінний матеріал для дослідження - кров, сліди якої добре помітні і в них зазвичай багато ДНК. Але в плямі крові могли змішатися кров злочинця і жертви. Як відокремити клітини один від одного? Завдання дещо спрощується, якщо злочинець і жертва різностатевих: тоді можлива попередня сортування за наявністю або відсутністю Y-хромосоми. Взагалі робота зі змішаними об'єктами - це часто зустрічається ситуація: як правило, предмети, до яких торкався зловмисник, чіпав хтось і до нього, і там можна знайти біоматеріал, що належить десяткам людей. Для виділення потрібного матеріалу часом використовують кількісний метод: слід злочинця найсвіжіший, а значить, якщо кількість якихось клітин на поверхні об'єкта хоча б на порядок перевищує число інших, можна припустити, що це і є шуканий біоматеріал.

Типовий випадок: після згвалтування епітеліальні клітини жертви змішані зі сперматозоїдами злочинця. Для цього випадку створений спеціальний метод. Оскільки епітелій має меншу структурну міцність в порівнянні з чоловічими статевими клітинами, його можна зруйнувати спеціальними хімікатами, залишивши сперматозоїди неушкодженими і отримавши чисту фракцію клітин насильника.

Таким чином, власне молекулярно-генетичним дослідженням передує пошук необхідного матеріалу і виділення його з різних сумішей. Існують, наприклад, хімічні методи пошуку слідів крові там, де ці сліди намагалися відмити. Є технології пошуку клітин, залишених на папері та інших матеріалах.

відмивання ДНК

Інше питання - збереження біоматеріалу. З одного боку, прочитаний геном неандертальця і ​​мамонта, тобто ДНК може зберігатися десятки тисяч років. А з іншого - в плямі крові, залишеному злочинцем пару днів назад, ДНК може не виявитися зовсім. Як же так? «ДНК - це одна з найбільш стійких біомолекул, - пояснює Сергій Леонов. - Якщо є умови для зберігання, вона може залишатися в цілості майже необмежену кількість часу. Кращі умови - це висушування, наприклад на папері. Особисто мені доводилося брати участь в роботах по ідентифікації останків солдат, які загинули під час Великої Вітчизняної. ДНК, виявлені в останках, порівнювалися зі збереженими зразками ДНК з фронтових листів, які надавали родичі загиблих в цих місцях воїнів ».

ДНК швидко руйнується під впливом різних біологічних, хімічних і фізичних факторів. Якщо біоматеріал потрапляє у вологе середовище, тут же починається гниття. Гниття - це не що інше, як поїдання клітин бактеріями. Бактерії до того ж виділяють особливі речовини - нуклеази, які руйнують весь знаходиться поблизу генний матеріал: це зброя боротьби з вірусами. Якщо хустку з плямою крові став об'єктом гнильних процесів, може виявитися, що пляма крові є, а ДНК в ньому вже немає. Наявність і концентрація в зразках генного матеріалу будуть виявлені хімічними методами в ході хімічного аналізу, однак до того, як це станеться, необхідно екстрагувати ДНК з клітинної середовища. «Для цього, - говорить Сергій Леонов, - застосовуються спеціальні реагенти, які повністю руйнують матеріал клітини, залишаючи лише ДНК. Потім ДНК електростатично зв'язується з сорбентом, який витягується, а потім змивається водою. Так виходить чистий водний розчин ДНК ». Якщо згідно з подальшого аналізу генний матеріал є в розчині і в необхідній кількості, можна приступати до створення генетичного «відбитка».

На схемі показана класична схема генетичного аналізу з використанням агарозного гелю. Маркери рухаються під впливом електричного поля в блоці гелю. Оскільки маркери меншого розміру зустрічають менший опір гелю, вони вириваються вперед. Остаточна ідентифікація маркерів відбувається за допомогою лазерного підсвічування, збудливою флюоресценцію.

Користь від мовчання

Насамперед слід зауважити, що порівнювати повністю дві ДНК ніякої потреби немає. Генетично все люди на Землі ідентичні на 99,99%, і тому є сенс аналізувати лише подібність-відмінність певних ділянок геному, які мають поліморфізмом, тобто представлені у різних людей в декількох різних видах. «Золотим стандартом» на сьогоднішній день вважається дослідження поліморфних маркерів, що мають змінну довжину. Маркери - це ділянки «мовчить» ДНК, які не виступають в якості діючих генів і не кодують білки. Зате вони мають характерну структуру - одні й ті ж послідовності пар основ повторюються в них кілька разів. Різне число повторів і формує той самий поліморфізм. Зрозуміло, число варіантів довжини одного маркера не дорівнює числу людей на Землі. Якщо у маркера є (умовно) десять варіантів, то володіння маркером певної довжини означає лише приналежність до однієї з десяти груп людства, чисельністю в сотні мільйонів чоловік кожна. Але якщо ми додамо сюди дані по другому поліморфний маркера, група, де зустрічається таке поєднання довжин, помітно звузиться. Йтиметься вже про мільйони чоловік. При додаванні нових маркерів буде, як кажуть в науці, експоненціально наростати дискримінаційний потенціал, і нарешті, число маркерів можна довести до такого кількості, коли поєднання даних по їх довжині стане унікальним для окремої особистості, а ймовірність повтору цього «малюнка» практично зведеться до нуля . Ключ до ідентифікації особистості - всього-то дюжина поліморфних маркерів. Але тут ми згадаємо, що ДНК - об'єкт мікросвіту, і ні лінійкою, ні штангенциркулем її ділянки поміряти неможливо. Тут на допомогу приходить біохімія та електрику.

конструктивний бульйон

Молекули, навіть такі складні, як ланцюжки ДНК, настільки малі, що для молекулярно-генетичного дослідження потрібно не одна копія цікавить нас ділянки геному (маркер), і не десять, і не сто, а мільйони і мільярди. Потрібно, таким чином, значна концентрація копій маркерів, яка зробить можливим фізичну індикацію параметрів. Ядро, найскладніший момент всієї технології ідентифікації особистості - полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), яка як раз і дозволяє накопіровать маркерів стільки, скільки потрібно. Реакція відбувається в розчині, де присутні досліджувані ДНК, своєрідні мітки-праймери (фактично конструктивно ідентичні невеликих ділянках однієї нитки ДНК), що знаходяться в «вільному плаванні» формують ДНК азотисті основи - аденін (A), гуанін (G), цитозин ©, тимін (T), каталізатори і, нарешті, головний діючий персонаж - фермент Taq-полімераза. Реакція відбувається при змінних температурних режимах. Спочатку за допомогою нагрівання ДНК денатурируется, тобто її «подвійна спіраль» розпадається на дві нитки, а пари підстав розмикаються. Потім при охолодженні праймери відзначають кордону цікавить нас маркера. Вони примикають до ниток ДНК, на невеликій ділянці як би відновлюючи подвійну структуру молекули. Після цього полімераза «бере» з розчину азотисті основи і, працюючи по одну сторону маркера, добудовує другу нитку для кожної з ниток денатурированной ДНК. У підсумку замість однієї ДНК в розчині з'являються дві молекули з частково відновленої подвійною структурою (зокрема, для маркера). Потім все повторюється: денатурація з поділом двох ниток, праймери і робота полімерази. В результаті ланцюгової реакції ми отримуємо величезну кількість копій має нормальну подвійну структуру маркера.

«ПЛР - дуже складний і дорогий процес, - каже гендиректор компанії Gordiz Володимир Орєхов. - Кількість компаній в світі, які випускають реагенти для такої реакції, можна порахувати на пальцях однієї руки, і одна з них - наша - знаходиться в Росії. Головна складність в тому, що в пробірці одночасно повинні копіюватися всі маркери і при цьому не заважати один одному. Скільки потрібно маркерів? Американський стандарт CODIS включає в себе 13, європейський ESS - 12. Хоча маркери з двох систем перетинаються, є і відмінності. Щоб задовольнити потреби фахівців, що працюють в рамках різних стандартів, ми випускаємо реагенти для ПЛР за участю 19 маркерів. Такої кількості вистачить для ідентифікації унікальної особистості, навіть якщо населення Землі зросте на кілька порядків. Є у нас і своє ноу-хау. Справа в тому, що зазвичай реагенти для ПЛР випускаються в рідкому вигляді, що висуває особливі вимоги до умов зберігання і транспортування (зокрема, потрібна заморозка). Ми виробляємо реагенти методом висушування сирих сумішей, і ніяких особливих умов для транспортування їм не потрібно. Все це здешевлює процес і спрощує завдання доставки реагентів, наприклад, у віддалені райони. Зазначу, що вся сировина для реагентів вітчизняного виробництва ».

Генетичний аналізатор - це апарат, який представляє більш просунуту технологію сортування виділених з ДНК маркерів. Тут маркери рухаються в капілярах з пористого полімеру. На фото представлений прилад «НАНОФОР-05», випущений російською компанією «Синтол».

Гонки в поле

Продукт ПЛР - розчин з високою концентрацією маркерів - це вже готова база для проведення замірів. Методики можуть дещо відрізнятися, але в основі їх лежить процес, знайомий багатьом, хто відвідував кабінети фізіотерапії в поліклініках. Це електрофорез - рух заряджених молекул в електричному полі.

«До сих пір в Росії користуються методом поділу продукту ПЛР на поліакриламідному гелі, - розповідає Сергій Леонов. - На зміну цьому методу, який бере початок з 1980-х, прийшли генетичні аналізатори. У них рух молекул відбувається всередині капілярів з пористого полімеру. Але суть одна: маркер, будучи катіоном, при додатку електричного поля починає рухатися, проте через опір середовища довша молекула гальмує, а коротка пересувається швидше ».

Таким чином, молекули сепаруються по довжині. Правда, деякі маркери можуть мати однакову довжину (однакове число пар основ), розрізняючи при цьому за структурою розміщення підстав. Щоб уникнути плутанини, потенційно схожі за розмірами маркери ще в процесі ПЛР отримують флюоресцентную мітку (одного з чотирьох або п'яти кольорів). У генетичному аналізаторі маркери підсвічуються лазером, промінь якого збуджує світіння певного кольору. Після цього маркер може вважатися остаточно ідентифікованим. Підсумковий документ аналізатора - таблиця, в якій кольором відмічено наявність в геномі тих чи інших варіантів (алелей) всіх досліджуваних маркерів. І це все?

без свідків

«Ні, не все, - каже Володимир Орєхов. - Якщо збігаються зразки сліду і живої тканини, виникає питання статистики - наскільки ймовірно збіг. Теоретично ймовірність існує, і за підсумками молекулярно-генетичних досліджень ймовірність 100% не видається. Інша справа, що ймовірність точної ідентифікації становить 99% плюс багато цифр після коми. Але щоб висновок мала всі ознаки науковості, цю ймовірність треба порахувати математично з урахуванням, наприклад, популяційних частот для кожної ознаки (поширений ознака - більша ймовірність збігу, рідкісний - менше). У зв'язку з цим існує міф про те, що якісь види криміналістичних експертиз дають однозначну відповідь «так» або «ні», а генетична експертиза дає лише кількісну оцінку ймовірності. Але насправді найточнішу відповідь дає саме генетика, а, наприклад, почерковеденіе або дактилоскопія можуть помилятися, і такі випадки відомі. Звичайно, в генетичну експертизу може втрутитися людський фактор (лаборант переплутав зразок і т. П.), Але якщо дослідження проведено правильно, воно дає строго науковий і точний результат ».

З плином часу молекулярно-генетична експертиза стає все більш поширеним і все менш дорогим методом криміналістики. При цьому ефективність її вкрай висока. З 1990-х років в США, Німеччині, Великобританії діють закони про геномної реєстрації. Згідно з цими нормативними актами досліджується і заноситься в базу даних біологічний матеріал, надісланий на місці злочину не встановленими особами. У цю ж базу заноситься генний «паспорт» людей, які відбувають покарання за особливо тяжкі злочини. Така база виявилася досить ефективним засобом розкриття злочинів, в яких немає ні підозрюваних, ні свідків, так як у великій кількості випадків непізнаний генетичний матеріал рано чи пізно знаходив за допомогою бази свого господаря або показував зв'язок з іншими досконалими злочинами. Такий закон прийнятий в 2009 році і в Росії, проте фінансування його почалося лише недавно, і говорити про серйозне ефекті для нашої країни поки передчасно.

Стаття «Друк гена» опублікована в журналі «Популярна механіка» ( №9, Сентябрь 2015 ).