1 Кривенцов Ю.А. 1 Гудінські Н.І. 1 Крівенцева М.Ю. 2 Носков О.І. 1
1 ГБОУ ВРО «Астраханський державний медичний університет Міністерства охорони здоров'я Росії»
2 ГБУЗ АТ «Патологоанатомічне бюро»
На основі оптимізації алгоритму кількісного аналізу фетального гемоглобіну методом ракетного електрофорезу в агарових гелі з додецилсульфатом натрію, розроблений імунохімічний тест на цей білок, що відрізняється абсолютною специфічністю, високою чутливістю (поріг чутливості - 1,71 ± 0,26 мг / л) і точністю (максимальна похибка ± 2,1%). За допомогою нового тесту проведена клінічна апробація тесту на фетальний гемоглобін в 471 зразку крові від 287 пацієнтів, хворих на туберкульоз легень різних форм. Аналіз результатів дослідження показав статистично значуще підвищення відносної концентрації фетального гемоглобіну (у відсотках від рівня загального гемоглобіну) по відношенню до показників у групі контролю (здорові донори). Проведений кількісний імунохімічний аналіз фетального гемоглобіну крові в досліджуваних клінічних вибірках в динаміці показав високу зворотну кореляцію між рівнем досліджуваного білка і термінами терапії патологічного процесу тільки в групі пацієнтів, які перенесли оперативне втручання. Оцінка діагностичної значущості розробленого імунохімічного тесту на фетальний гемоглобін показала високі значення діагностичної ефективності та абсолютні показники специфічності, що є безперечною перевагою тесту і пояснюється повною відсутністю хибнопозитивних результатів при його застосуванні.
діагностика
тест-система
імунохімія
фетальний гемоглобін
туберкульоз
1. Чабанова О.Н. Епідеміологічні та медико-соціальні проблеми туберкульозу / О.М. Чабанова, Е.Н. Стрельцова, А.Г. Сердюков. - Астрахань, 2010. - С. 9-16.
2. Бойко О.В. Молекулярні механізми бактеріоносійство (характеристика і детальний аналіз) / О.В. Бойко, А.А. Терентьєв, В.І. Бойко. - Palmarium academic publishing, Saarbrücken, Germany, 2012. - С. 67-72.
3. Тюлькина Е.А. Фактична функція лікарської посади лікаря-фтизіатра в Удмуртської Республіці // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2017. - № 6. - URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27156 (дата звернення: 25.05.2018).
4. Рижкова О.А. Структурний аналіз сироватки крові при туберкульозі / О.А. Рижкова, Е.Н. Стрельцова. - Астрахань: Видавничий дім «Астраханський університет», 2010. - С. 65-69.
5. Топунов А.Ф. Гемоглобіни і системи їх відновлення / А.Ф. Топунов, О.В. Космачевський // Нові інформаційні технології в медицині, біології, фармакології та екології: матеріали Міжнародної конференції / за ред. Е.Л. Глоріозова. - 2017. - С. 32-38.
6. Діамант С.А. Гетерогенність білкових фракцій гемоглобіну кісткового мозку і системи крові при екстремальних впливах на організм / С.А. Діамант, Б.Г. Юшков // Медична імунологія. - 2017. - Т. 19. - № 5. - С. 17-18.
7. Кривенцов Ю.А. Імунохімічний аналіз концентрації фетального гемоглобіну в крові новонароджених хлопчиків і дівчаток з внутрішньоутробною гіпоксією / Ю.А. Кривенцов, Д.М. Нікуліна, Р.А. Бісаліева // Омський науковий вісник. - 2006. - Т. 46, № 9. - С. 272-274.
8. Hoogewijs D. Androglobin, a new metazoan family of chimeric globins with a N-terminal calpain-like protease domain, preferentially expressed in vertebrate testes / D. Hoogewijs [et al.] // Mol. Biol. Evol. - 2012. - V. 29. - P. 1105-1114.
9. Шамратова В.Г. Фетальний гемоглобін - маркер кисневого дефіциту клітин при гіподинамії / В.Г. Шамратова, Е.Е. Ісаєва, С.Р. Усманова // Вісник Башкирського університету. - 2015. - Т. 20. - № 1. - С. 101-105.
10. Бойко О.В. Вплив Астраханського газопереробного заводу на забруднення повітря виробничих приміщень і території / О.В. Бойко, В.І. Бойко, Н.І. Гудінські // Гігієна і санітарія. - 2016. - Т. 95. - № 2. - С. 167-171.
11. Кривенцов Ю.А. Гемоглобіни людини: іммунобіохіміческіе характеристика та медико-біологічне значення: автореф. дис. ... докт. мед. наук. - М., 2009. - 42 с.
12. Бісаліева PA Імунохімічний аналіз фетального гемоглобіну в крові наркологічних хворих / PA Бісаліева, Ю.А. Кривенцов, Р.В. Бісаліев, BC Кальной // Наркологія. - 2009. - Т. 8. - № 1. - С. 95-97.
Згідно з даними медичної статистики, з початку століття і по теперішній час захворюваність на туберкульоз в Росії дуже повільно, але неухильно знижується. Проте, не дивлячись на успіхи останніх десятиліть в галузі фтизіатрії і державних програм щодо попередження даної патології, туберкульоз залишається однією з найактуальніших проблем соціального характеру, щорічно приводить до тривалої непрацездатності та інвалідизації десятки тисяч громадян нашої країни. Слід зазначити, що найпоширеніша форма цього захворювання - туберкульоз легенів, традиційно вражає переважно самі працездатні верстви населення - осіб молодого і зрілого віку, демографічну основу російських народів, приводячи, в масштабах країни, як до погіршення здоров'я популяції, так і до суттєвих економічних втрат . У цьому світлі гостра проблема боротьби з туберкульозом є не тільки медичною, а й загальнодержавним завданням [1-3].
У рішенні проблеми туберкульозу в нашій країні значну роль відіграють федеральні програми, спрямовані на повільний, але неухильне зростання добробуту середнього росіянина, поліпшення загальної ситуації в сфері охорони здоров'я, профілактичні заходи, регулярне медичне обстеження населення, пропаганду здорового способу життя та ін. Однак, незважаючи на це, навіть в XXI столітті захворюваність на туберкульоз залишається дуже високою. Пояснюється це тим, що, по-перше, навіть щорічна планова диспансеризація не в силах охопити всі верстви населення, по-друге, методи сучасного скринінг-обстеження (флюорографія та ін.) Не здатні виявити дану патологію на стадії активації процесу, коли ураження в легеневої тканини ще не носять манифестного характеру. Саме недоліки на етапі ранньої діагностики туберкульозу є однією з основних причин, що перешкоджають ефективному вирішенню описуваної проблеми [1; 2; 4].
У світлі вищесказаного пошук нового неспецифічного маркера туберкульозного процесу і створення відповідного лабораторного тесту, здатного доповнити загальноприйняту діагностичну панель по даній нозології і тим самим поліпшити своєчасне виявлення туберкульозу на ранніх стадіях захворювання, є актуальним завданням сучасної медицини.
Високий інтерес в цьому сенсі являє фетальний (плодовий) гемоглобін людини (HbF). Цей гемсодержащих мультимера побудований з двох α- та двох γ-ланцюгів. pI - 6,9-7,15. Його продукція активується з 12-13-го тижня гестації, і до моменту народження його концентрація в крові становить 55-85% від загального гемоглобіну. У дорослого на частку HbF припадає близько 1,5% від загального гемоглобіну [5-7].
Виходячи з літературних даних останніх років, які доводять діагностичну значимість імунохімічного тесту на фетальний гемоглобін, як надійний маркер хронічної гіпоксії різного генезу [8-10], авторами було зроблено припущення, що зміна продукції цього протеїну цілком ймовірно при туберкульозному процесі легенів, часто супроводжується хронічними гіпоксеміческіе явищами.
Мета дослідження: розробка нового імунохімічного тесту на фетальний гемоглобін для оцінки тяжкості ураження легень, визначення прогнозу, моніторингу лікування туберкульозу легенів і аналіз його діагностичної значущості.
Матеріали і методи дослідження
Це дослідження проведено в період з 2015 по 2017 г. Як клінічного матеріалу використовувалася гемолізовані кров хворих на туберкульоз легень і здорових донорів (контрольна група) загальною чисельністю 471 зразок, узятий від 287 осіб (табл. 1). Матеріал отримували в ГБУЗ АТ «Обласний клінічний протитуберкульозний стаціонар» і на Астраханській обласній станції переливання крові.
Таблиця 1
Перелік використаного в роботі матеріалу
матеріал
число зразків
число осіб
Кров хворих на туберкульоз легень
вогнищева форма
інфільтративна форма
диссеминированная форма
фіброзно-кавернозна форма
післяопераційні реконвалесценти
410
92
86
54
88
90
226
58
49
30
42
47
Кров здорових донорів (групи контролю)
61
61
всього
471
287
Клінічний аналіз форм даної нозології проводився за участю кваліфікованих фтизіатрів.
Для оцінки сатурації крові використовували пульсоксиметр.
Для очищення препарату HbF використовували методи термічно-механічного гемолізу, лужного осадження (поетапна обробка біоматеріалу розчином сульфату амонію 50% насиченості і 1,25 М розчином NaOH з подальшою седиментацією при 6000 g), електрофоретичного фракціонування в агарових гелі на 0,15 М цитратному буфері з рН 6,2 (в авторській модифікації), електрофорезу в поліакриламідному гелі, іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-сефадексе А-50 і гель-проникаючої хроматографії на сефадексе G-200. Антисироватки отримували шляхом імунізації кроликів малими дозами очищеного препарату HbF з повним ад'ювантом Фрейнда за загальноприйнятою схемою. Для кількісного аналізу загального гемоглобіну в досліджуваних пробах застосовували уніфікований гемоглобінціанідний метод.
Для селективної кількісної реєстрації фетального гемоглобіну в досліджуваних зразках використовували розроблений і запатентований раніше метод ракетного електрофорезу в агарових гелі з додецилсульфатом натрію (ДСН) [11; 12].
При аналізі діагностичної значущості пропонованого тесту на HbF референтна оцінка носила альтернативний характер, а досліджуваний тест давав кількісний результат. В цьому випадку використовували точку поділу (дискримінантного концентрацію), перевищення якої вважається достатньою підставою для якісної оцінки. Числове значення точки поділу за кожним показником вибирали як суму (або різницю, в залежності від вектора відхилення досліджуваної ознаки при даній патології) середнього значення досліджуваного білка в групі контролю і чотириразового середнє відхилення (М ± 4σ). Нормальним вважалася концентрація, що не перевищує дискримінантний рівень. Підвищеним вважали показник, який більш ніж на 10% перевищував точку поділу. При такому підході кількісний результат оцінювався так само, як альтернативний.
Для математичного аналізу і оцінки статистичної значущості отриманих результатів використовували ліцензійний пакет прикладних програм статистичного аналізу Excel 2016 (Microsoft) і Statistica 6.0 (Stat Soft, Inc., США). Обчислювали середні величини (М) в кожній вибірці, середні помилки середньої арифметичної (m). З метою визначення значущості р відмінностей порівнюваних середніх величин застосовували критерій t Стьюдента з поправкою Бонферроні і однофакторний дисперсійний аналіз з обчисленням критерію F Фішера. Відмінності вважали достовірними при р <0,05. Для аналізу залежності між порівнюваними групами проводили лінійний кореляційний аналіз Пірсона (коефіцієнт кореляції - r). Кореляція вважалася високою при наближенні модульної величини r до одиниці. Статистичні взаємозв'язки між показниками оцінювали застосуванням кореляційного, регресійного аналізу та методів багатовимірної статистики.
Результати дослідження та їх обговорення
Дане дослідження було закономірним продовженням проведеної раніше роботи, в ході якої був оптимізований спосіб виділення HbF, отримані моновалентні антисироватки на цей білок, змодельована відповідна імунохімічний тест-система (в якій тест-антигеном був гемолізат пуповинної крові новонароджених в розведенні: 1/128, поріг чутливості тест-системи - 2,23 ± 0,25 мг / л (р <0,005)). Для кількісного аналізу HbF розроблений спосіб ракетного електрофорезу в агарових гелі з ДСН, що відрізняється абсолютною специфічністю визначення HbF, точністю (максимальна похибка ± 2,1%), високою чутливістю (поріг чутливості - 1,71 ± 0,26 мг / л), значущістю реєстрації, в тому числі і при визначенні малих величин гемоглобіну (F = 8,2; р <0,01). Кореляційний аналіз показав високу пряму залежність концентрації досліджуваного білка від квадрата діаметра кільця преципітації (r = 0,94; p <0,001). Широка клінічна апробація тесту показала високу значимість фетального гемоглобіну як неспецифічного маркера хронічної гіпоксії [7; 11].
При трактуванні отриманих даних в даній роботі виникала проблема вибору підходів до оцінки концентрації HbF. Справа в тому, що у значної частки пацієнтів (23%) досліджуваної вибірки відзначалася анемія різного ступеня вираженості. Отже, аналіз рівня фетального гемоглобіну за абсолютними величинами (г / л) був неможливий, тому що рівні загального гемоглобіну у різних пацієнтів (з анемією і без) значно різнилися, то не вилучалися варіанти, при яких видима зміна концентрації HbF фактично могло виявитися недостовірним в силу пропорційної зміни рівня загального гемоглобіну.
Тому, для максимальної верифікації отриманих результатів по фетальному гемоглобіну, в тих же вибірках нами було проведено конвертацію абсолютних величин концентрації (г / л), отриманих в ході імунохімічного дослідження, в відносні величини - відсоток HbF від загального гемоглобіну в кожної нозологічної групі. Отримані дані (в%) в цілому адекватно співвідносилися з результатами визначення досліджуваного білка.
Проведено кількісний імунохімічний аналіз HbF методом ракетного електрофорезу з ДСН в представлених клінічних групах (табл. 2).
Таблиця 2
Результати імунохімічного визначення HbF в досліджуваних групах
Досліджувані форми туберкульозу легенів
n
Середній п роцент HbF від загального Hb
До орреляція рівня HbF з сатурацією крові (r)
вогнищева форма
92
2,24 ± 0,09
-0,76
Инфильтративная форма
86
3,46 ± 0,12
-0,80
дисемінована форма
54
5,31 ± 0,21
-0,84
Фіброзно-кавернозна форма
88
3,88 ± 0,19
-0,92
післяопераційні реконвалесценти
90
2,81 ± 0,13
-0,79
Здорові донори (контрольна група)
61
1,52 ± 0,07
всього
471
Як видно з таблиці 2, показані високі рівні зворотної кореляції між середніми концентраціями HbF і середніми показниками сатурації крові у всіх клінічних вибірках, що доводить значущість HbF як маркера гіпоксії.
Аналіз дисперсії з клінічних форм і відмінності між парними вибірками (контрольна група і пацієнти з відповідною патологією) виявилися статистично значущими у всіх групах:
- вогнищева форма туберкульозу легенів: коефіцієнт Стьюдента t = 3,97; довірча ймовірність помилки (р) <0,05; коефіцієнт дисперсії F = 4,9;
- інфільтративна форма: t = 4,22; р <0,05; F = 5,3;
- диссеминированная форма: t = 5,34; р <0,01; F = 5,7;
- фіброзно-кавернозна форма: t = 4,42; р <0,05; F = 5,4;
- післяопераційні реконвалесценти: t = 4,42; р <0,05; F = 5,4.
Відмінності рівнів HbF у хворих і здорових в цілому виявилися достовірними (р <0,01), так само як і між пацієнтами з різними формами туберкульозу (р <0,05).
На наш погляд, активація продукції HbF у хворих з туберкульозом легень є компенсаторною реакцією на гіпоксеміческіе зміни і пояснюється пролиферацией клону еритробластів, здатних до синтезу HbF. Можна припустити, що головним фактором, який регулює еритропоез, має бути ставлення між постачанням тканин киснем і їх потребою в цьому газі. Ймовірно, що метаболічні зміни, що стосуються латентною або розвинутою декомпенсації процесів газопостачання тканин у туберкульозних хворих, створюють то микроокружение еритроїдних клітин, яке впливає на їх програмування з переважним утворенням фетального гемоглобіну.
Був також проведений кількісний імунохімічний аналіз фетального гемоглобіну крові в клінічних вибірках в динаміці (у тимчасовому діапазоні з моменту надходження пацієнта в стаціонар по 12-й місяць терапії включно). Дане дослідження показало досить низькі (на межі достовірності) кореляційні зв'язки між рівнем HbF і термінами терапії патологічного процесу:
- вогнищева форма: коефіцієнт Пірсона (r) = -0,43 (р <0,05);
- інфільтративна форма: r = -0,51 (р <0,05);
- диссеминированная форма: r = -0,63 (р <0,05);
- фіброзно-кавернозна форма: r = -0,34 (р <0,05).
Очевидно, слабкі, невиражені тенденції до нормалізації рівня HbF в процесі лікування досліджуваних груп патології пояснюються тим, що, відповідно до специфіки нозології, протитуберкульозна терапія відрізняється тривалістю і далеко не завжди дає швидкий позитивний результат.
Виняток склала група пацієнтів, які перенесли оперативне втручання з видалення осередку ураження (туберкулема, інфільтрат і ін.). У цій вибірці була показана висока зворотна кореляція між середніми показниками HbF і терміном післяопераційної реабілітації (r = -0,85). Даний факт можна пояснити нормалізацією процесів тканинного дихання в результаті успішного хірургічного лікування.
На останньому етапі роботи була проведена оцінка діагностичної значущості (ДЗ) розробленого імунохімічного тесту на фетальний гемоглобін за всіма критеріями цього показника: діагностичної чутливості, діагностичної специфічності, прогностичності позитивного і негативного результатів, діагностичної ефективності.
Оскільки імунохімічний тест на фетальний гемоглобін давав кількісні результати, а його оцінка носила альтернативний характер (див. Вище), обчислена точка поділу по відносній концентрації HbF дорівнювала 1,77% від загального гемоглобіну.
Аналіз показників якості пропонованого тесту на HbF, як діагностичного інструменту при туберкульозі легенів, дав високі результати:
- чутливість тесту - 93,3%;
- специфічність - 100%;
- прогностичність позитивного результату - 100%;
- прогностичність негативного результату - 86,2%;
- діагностична ефективність - 96,7%.
Як показав аналіз ДЗ, імунохімічний тест на HbF має абсолютні показники специфічності, високі значення діагностичної ефективності і прогностичності позитивного результату, що є безперечною перевагою тесту і пояснюється повною відсутністю хибнопозитивних результатів при його застосуванні.
Висновок
Клінічна апробація розробленого імунохімічного тесту на фетальний гемоглобін показала його спроможність. З огляду на повну специфічність і високу діагностичну ефективність запропонованого тесту, можна зробити висновок, що його широке впровадження в клінічну практику, безумовно, ефективно доповнить загальноприйняту діагностичну панель туберкульозу легенів.
бібліографічна ПОСИЛАННЯ
Кривенцов Ю.А., Гудінські Н.І., Крівенцева М.Ю., Носков О.І. НОВИЙ ІМУНОХІМІЧНИЙ ТЕСТ НА фетального гемоглобіну у діагностиці ТУБЕРКУЛЬОЗУ ЛЕГЕНЬ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2018. - № 3 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27657 (дата звернення: 08.06.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, что видають у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?Ru/ru/article/view?
