Люмбальна пункція проводиться головним чином з метою отримання ЦСР для лабораторного дослідження, а також з лікувальною метою.
показання
1. Підозра на інфекційні захворювання ЦНС (менінгіт або енцефаліт).
2. Підозра на внутрішньочерепний (субарахноїдальний або внутрішньомозковий) крововилив (якщо КТ неможлива або дає негативні результати).
У лікувальних цілях до люмбальної пункції вдаються для дренування ЦСР і зниження тиску (наприклад, при нормотензівной гідроцефалії, доброякісної внутрішньочерепної гіпертензії або субарахноїдальний крововилив), ендолюмбального введення лікарських засобів (наприклад, антибіотиків при менінгітах).
Протипоказання
1. Інфекція в місці передбачуваної пункції.
2. Підозра на об'ємний процес (абсцес, пухлина, субдуральна гематома), особливо в задній черепній ямці, на що вказують наростаючі симптоми внутрішньочерепної гіпертензії, прогресуючі осередкові симптоми, застійні диски зорових нервів. У цих випадках перед проведенням люмбальної пункції потрібно обов'язково досліджувати очне дно і провести ЕхоЕС.
3. Виражена тромбоцитопенія (менше 40 тис. / Мкл) або зниження часу згортання крові (більш ніж на 50%).
Однак в двох ситуаціях, незважаючи на протипоказання, люмбальна пункція все ж доводиться проводити: при наявності набряку дисків зорових нервів - коли є підозра на гнійний менінгіт, при доброякісної внутрішньочерепної гіпертензії. В обох випадках перед проведенням люмбальної пункції потрібна консультація невролога або нейрохірурга.
Методика проведення люмбальної пункції. Для успішного проведення люмбальної пункції вирішальне значення має правильне положення хворого. Безпосередньо перед пункцією йому надають ембріональну позу, укладаючи на бік і максимально нахиляючи голову і згинаючи ноги в колінних і тазостегнових суглобах. На рівні лінії, що з'єднує верхні задні ості клубових кісток, між остистими відростками хребців пальпаторно визначають проміжок L3-L4, в якому зазвичай виробляють пункцію. Але оскільки спинний мозок закінчується на рівні L1, допустимо проведення проколу вище цього рівня (в проміжку L2-L3) або нижче (в проміжку L4-L5). Перед пункцією шкіру обробляють йодом, починаючи з місця передбачуваної пункції і далі у вигляді концентричних кіл. Потім йод ретельно видаляють спиртом, щоб уникнути його потрапляння в субарахноїдальний простір. Місце пункції оточують стерильною простирадлом. Проводять анестезію місця передбачуваної пункції 0,5% розчином новокаїну. Спочатку розчин вводять під шкіру, домагаючись отримання «лимонної кірки», а потім ще кілька мілілітрів ін'єктують в більш глибокі шари. У пункційну голку вставляють мандрен, проколюють шкіру і уточнюють напрямок голки. Голку вводять по середньої лінії строго горизонтально, але її кінець направляють злегка під кутом до голови (паралельно остистих відростках), приблизно у напрямку до пупка. Зріз голки повинен бути паралельний осі хребця. У міру введення голки послідовно долається опір жовтої зв'язки і твердої мозкової оболонки. Після проколу твердої мозкової оболонки голку вводять дуже повільно, час від часу витягуючи мандрен, щоб перевірити, чи не витікає ЦСР. При попаданні в субарахноїдальний простір виникає відчуття провалу. При появі ЦСР голку просувають ще на 1-2 мм, а її зріз повертають перпендикулярно осі хребта. Потім хворого просять розслабитися і обережно випрямити голову і ноги. Після вилучення мандрена, не допускаючи закінчення ЦСР, до голки приєднують манометр і вимірюють тиск ЦСР, яке в нормі становить 100-150 мм вод.ст. При необережному введенні голки можна просунути її занадто далеко і проколоти венозний сплетіння, що призведе до появи крові в ЦСР ( «травматична пункція»).
Закінчення ЦСР можна підсилити за допомогою покашлювання, натискання на живіт або яремні вени. Ці прийоми ускладнюють венозний відтік від спинного мозку і підвищують тиск. Якщо голка не потрапила в субарахноїдальний простір або вперлася в кістку, її треба потягнути на себе, не витягуючи повністю (зріз повинен залишитися під шкірою) і, змінивши напрям, ввести знову.
ЦСР збирають не менше ніж в 3 стерильні пробірки: в першу - для вимірювання концентрації білка і глюкози, після чого вміст пробірки центрифугують, а осад піддають бактеріоскопії; в другу - для визначення клітинного складу і серологічного дослідження; в третю пробірку - для бактеріологічного дослідження ліквору. При підозрі на туберкульозний менінгіт беруть четверту пробірку - для виявлення фибриновой плівки. При високому тиску ЦСР слід витягувати лише невелика її кількість, але в інших випадках не слід занадто обмежувати обсяг виведеної рідини, так як основні втрати відбуваються через дефект мозкових оболонок, пройдений голкою (до 30 мл і більше), до того ж швидкість продукції ЦСР досить велика (20 мл / год). Щоб зменшити дефект, слід використовувати більш тонкі голки, а зріз голки направляти паралельно осі хребта, так як при цьому голка розсовує, а не розриває волокна.
Після забору ЦСР голку витягують. Іноді при вставлянні мандрена перед витяганням голки може відбутися утиск корінця з подальшим його відривом, тому голку рекомендують витягувати без мандрена.
Якщо проведення люмбальної пункції неможливо через кісткових аномалій або інфекцій в місці пункції, то вдаються до субокципитальной пункції.
Ускладнення. Найбільш грізним ускладненням люмбальної пункції є вклинення, зазвичай виникає у хворих з об'ємним процесом на тлі внутрішньочерепної гіпертензії. Раптове падіння тиску в хребетному каналі може спровокувати вклинення мигдаликів мозочка у великий потиличний отвір або гачка гіпокампу в вирізку намету мозочка. Тому, якщо тиск ЦСР виявилося високим, для дослідження слід витягти лише мінімальна кількість ЦСР і, призначивши маннитол і кортикостероїди, встановити спостереження за хворим. При погіршенні стану під час люмбальної пункції або високий ризик вклинення голку зі вставленим мандреном іноді залишають на місці і вводять манітол внутрішньовенно крапельно (1,0-1,5 г / кг протягом 20-30 хв) і високі дози кортикостероїдів (10 мг дексаметазону внутрішньовенно струменево), після чого пункційну голку видаляють.
При повному або частковому блокаді субарахноїдального простору, зумовленої здавленням спинного мозку, наприклад пухлиною, витяг ЦСР може привести до спінальному вклинення з швидким наростанням осередкової симптоматики. Про наявність спинального блоку свідчать результати ликвородинамических проб, ксантохромия в ЦСР (за рахунок підвищення білка) і низький тиск.
У 10-30% хворих виникає постпункціонная головний біль, пов'язаний з тривалим закінченням ЦСР через отвір у твердій мозковій оболонці, що призводить до внутрішньочерепної гіпотензії. Біль найчастіше локалізується в лобовій і потиличної областях, виникає в перші 3 доби після пункції і зазвичай триває від 2 до 5 днів, але іноді затягується на кілька тижнів. Характерно посилення головного болю у вертикальному положенні і зменшення в горизонтальному. Вона посилюється при струшуванні головою, здавленні яремних вен, але зменшується при здавленні живота. Болі іноді супроводжують легка ригідність шийних м'язів, світлобоязнь, запаморочення. Лікування цього ускладнення полягає в дотриманні постільного режиму, прийом рідини, внутрішньовенному або внутрішньом'язовому введенні 400-600 мг кофеїн-бензонат натрію. Постпункціонную головний біль можна звести до мінімуму, якщо застосовувати тонкі голки, вводити голку паралельно волокнам твердої мозкової оболонки, а перед видаленням голки обережно повернути хворого живіт. Постільний режим після люмбальної пункції не завжди запобігає головний біль, проте зазвичай хворим рекомендують лежати після люмбальної пункції на животі 2-3 години. У частини хворих після пункції зберігається корінцевий біль. Зрідка відзначається минуще ураження відвідного нерва з появою двоїння і паралітичного сходиться косоокості. Можливий розвиток менінгіту, якщо голка проходить через інфіковані тканини. Вкрай рідкісні ускладнення - епідуральна гематома зі здавленням кінського хвоста (зазвичай у хворих з коагулопатией) і холестеатома.
Дослідження цереброспінальної рідини. При отриманні кров'яною ЦСР потрібно перш за все отдифференцировать субарахноїдальний крововилив від травматичної пункції. Для цього рекомендують оцінити домішки крові в трьох послідовно зібраних пробірках: в разі «шляховий» крові ЦСР від першої до третьої пробірці буде поступово очищатися (відповідно, число еритроцитів від пробірки до пробірці буде зменшуватися), а при внутрішньочерепному крововиливі ЦСР у всіх трьох пробірках буде забарвлена однаково. Але більш надійний диференційний ознака - наявність ксантохроміі (результат деградації гемоглобіну з розпалися еритроцитів), яка з'являється через 2-4 години від моменту крововиливу. Слід враховувати, що ксантохромия буває також результатом гипербилирубинемии або підвищеного вмісту білка (> 1 г / л). Прозорість ЦСР оцінюють, порівнюючи її з водою. При підвищеному вмісті білка (> 1 г / л) ЦСР виглядає жовтуватою, а при наявності 200-300 лейкоцитів в 1 мкл стає мутнуватої. При метастазах меланоми або жовтяниці ЦСР може бути темною. Клітинний склад ЦСЖ потрібно досліджувати якнайшвидше (при кімнатній температурі лейкоцити швидко розпадаються, і вже через півгодини їх число зменшиться наполовину). При наявності домішки крові вихідне число лейкоцитів в ЦСР можна розрахувати, виходячи з того, що при нормальній картині крові на кожні 700 еритроцитів припадає приблизно 1 лейкоцит (при анемії повинні бути внесені корективи).
Збільшення числа клітин в ЦСР (плеоцитоз) може відбуватися за рахунок нейтрофілів або лімфоцитів. Значний нейтрофільний плеоцитоз характерний для бактеріальної інфекції, лімфоцитарний - для вірусних і хронічних запальних захворювань. Однак на ранній стадії розвитку гнійного менінгіту цитоз може бути невисоким, з переважанням лімфоцитів, тоді як при серозний менінгіт в ЦСР можуть переважати нейтрофіли, і лише повторна люмбальна пункція (через 10-12 годин) дозволяє уникнути діагностичної помилки. Збільшення числа лейкоцитів відзначається після субарахноїдального крововиливу і тромбозу венозних синусів. Еозинофіли характерні для паразитарних захворювань. Багато органічні захворювання ЦНС супроводжуються невеликим плеоцитозом. У всіх випадках плеоцитоза, навіть якщо клітинний склад характерний для інфекційного захворювання, необхідно ретельне бактеріологічне дослідження ЦСР. При карциноматозі мозкових оболонок плеоцитоз зазвичай не перевищує 100 клітин в 1 мкл.
Рівень глюкози в ЦСР в нормі становить 50-60% вмісту глюкози в крові (в нормі 2,8-3,9 ммоль / л). При гіперглікемії відносно низький рівень глюкози (наприклад, при бактеріальному менінгіті) можна прийняти за нормальний, тому, щоб оцінити цей показник, потрібно знати зміст глюкози в крові. Зниження вмісту глюкози - можлива ознака бактеріального, туберкульозного, грибкового або Канцероматозний менінгітів.
Вміст білка в ЦСЖ в нормі становить від 0,2 до 0,45 г / л. У нормі близько 70% білка ЦСР становить альбумін і близько 12% - g-глобуліни. Білки в ЦСР потрапляють з плазми шляхом селективного транспорту або ж синтезуються в самому подпаутинном просторі. Тому підвищення концентрації білка в ЦСЖ може виникати як в результаті загального порушення імунологічного статусу в організмі, так і в результаті порушення гематоенцефалічного бар'єру, уповільненою реабсорбції або підвищеного локального синтезу імуноглобулінів (Ig). Вміст білка наростає при менінгітах та енцефалітах, нейросифилисе, карциноматозі і деяких інших формах пухлин головного мозку. При пухлинах спинного мозку або блокаді субарахноїдального простору вмісту білка може підвищуватися в 10-20 разів. Значне збільшення рівня білка відзначається при синдромі Гієна - Барре (починаючи з 2-го тижня захворювання), хронічної запальної демієлінізуючих поліневропатії. При наявності домішки крові в лікворі вихідне вміст білка можна розрахувати, враховуючи, що при додаванні 700 еритроцитів рівень білка підвищується на 0,1 г / л. Підвищення Ig може спостерігатися і при нормальному вмісті загального білка в ЦСР. Так, підвищення Ig виявляється при розсіяному склерозі, синдромі Гієна - Барре, нейросифилисе. Швидкість синтезу Ig в подпаутинном просторі може бути виражена лікворних індексом IgG. Він визначаться як співвідношення IgG в лікворі / в сироватці. У нормі лікворному індекс коливається від 0 до 0,7. Цей індекс у 70% хворих з клінічно достовірним розсіяним склерозом перевищує 0,7. Виявлення олігоклональних IgG методом ізоелектричного фокусування ліквору також має велике значення для діагностики розсіяного склерозу. Однак виявлення олігоклональних груп IgG не є специфічним тільки для розсіяного склерозу. Вони виявляються при інших захворюваннях ЦНС запальної і інфекційної природи. Показники ЦСР при різних станах представлені в табл. 1.
Методи виявлення збудника. Вирішальну роль в діагностиці та лікуванні інфекційних хвороб відіграє визначення збудника. Виявити збудник в організмі хворого можна шляхом безпосередньої мікроскопії, бактеріологічного посіву, біологічної проби на тваринах, вірусологічних, серологічних методів дослідження і ДНК-діагностики.
Для мікроскопії та бактеріологічних посівів використовують кров, ЦСР, сечу, слиз з носа і глотки, кал, різні патологічні виділення. Кількість колоній, що виросли при мікробіологічних дослідженнях залежить від числа посіяних мікроорганізмів і їх життєздатності до моменту посіву. Це означає, що обсяг і кількість ЦСР, спрямованої на мікробіологічне дослідження, і швидкість її доставки безпосередньо позначаються на результатах дослідження. При підозрі на бактеріальну інфекцію виробляють фарбування приготованого мазка за Грамом. Для виключення туберкульозу осад ЦСР, отриманий при центрифугуванні, фарбують на кислотостійкі мікроорганізми. При підозрі на грибкове ураження препарат обробляють тушшю. Виявлення збудника в лікворі (бактериоскопически або методом посіву) є абсолютним доказом відповідної інфекційної хвороби ЦНС. Слід врахувати, що при мікроскопії мазка ЦСЖ далеко не завжди можна виявити збудника, при бактеріологічних посівах матеріалу необхідний час для отримання зростання мікроорганізмів (не менше 72 годин), а, наприклад, зростання мікобактерій туберкульозу можна отримати в культурі не раніше п'ятого тижня, що ускладнює своєчасну діагностику.
Біологічна проба на тварин застосовується, головним чином, при зоонози. Крім того, біологічна проба є єдиним достовірним лабораторним підтвердженням ботулізму.
Вірусологічні методи дослідження дуже трудомісткі і тривалі, що не дозволяє широко застосовувати їх для діагностики.
Для ідентифікації вірусів, а також ряду бактерій використовують серологічні методи, в основі яких лежить пряма взаємодія специфічних антитіл з антигеном. За допомогою антитіл, що містяться в діагностичних імунних сироватках, можуть бути ідентифіковані найрізноманітніші антигени, в тому числі і патогенних мікроорганізмів. Серологічні реакції дають можливість судити не тільки про динаміку накопичення антитіл в процесі захворювання, а й про напруженість імунітету, що виникає після профілактичних щеплень.
На практиці найбільш широко застосовуються реакції нейтралізації, зв'язування комплементу, аглютинації, преципітації, нейтралізації і ін.
Однак найбільш точними є серологічні реакції за участю мічених антигенів або антитіл - метод флуоресцентних антитіл (МФА) і імуноферментного аналізу (ІФА) (GT Wolker et al., 1995).
Принцип МФА полягає у взаємодії антигену і антитіла, міченого флюорохромом. Останній має властивість люминесцировать в потоці ультрафіолетових променів і не впливає на специфічність антитіл. Результати враховуються фотометрически. МФА є експрес-методом, який дозволяє вже через 2-3 години встановити з достатнім ступенем точності етіологічний діагноз. Так, при кліщовий енцефаліт максимальне число позитивних результатів МФА визначається в перші 3 дні хвороби.
ІФА (в іноземній літературі - ELISA) такоже Заснований на вікорістанні міченіх Антитіл. Принцип методу Полягає у віявленні антигену, фіксованого на Певної носії спеціфічнімі глобулінамі, міченімі ферментами. Фермент виявляється різними субстратами, що дають з ним характерне забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості досліджуваного антигену. Результати можуть враховуватися як візуально, так і інструментально (фотометрически). До теперішнього часу розроблені різні варіанти ІФА: прямий, непрямий, конкурентний, одинарний і подвійний сендвіч-методи і інші його модифікації, що дозволяє визначати окремі фракції імуноглобулінів, зокрема IgM. Це особливо важливо не тільки для ранньої діагностики ряду інфекційних захворювань (кліщовий енцефаліт, хвороба Лайма, гепатити, герпінфекціі і ін.), Але і для встановлення термінів зараження (цитомегаловірусна інфекція, токсоплазмоз, гепатити В, С та ін.).
У сучасній практиці успішно застосовуються методи ДНК-діагностики. Їх специфічність досягає 100%, а чутливість - 75-98%. Методи ДНК-діагностики по праву вважаються найшвидшими, чутливими і економічними методами не тільки діагностики, але і контролю за проведеним лікуванням. Вони дозволяють виділити збудник при найнижчих концентраціях в досліджуваному матеріалі, можуть використовуватися при серонегативного реакціях (наприклад, у хворих на СНІД), і результат готовий протягом кількох годин (К.Т. Моминаліев, В.М. Говорун, 2000; AM Wang, PE Mark, 1990).
До методів ДНК-діагностики відносять ампліфікаціонних технології, гібридизацію ДНК, методи ДНК-чипів і оптичні сенсори. Слід зазначити, що методи ДНК-діагностики не виключають, а лише доповнюють спектр традиційних методів, використовуваних в мікробіологічної і вірусологічної діагностики в даний час.
Ампліфікаціонних технології. В даний час найбільш широко використовується полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) як для наукових досліджень, так і в практичній охороні здоров'я. В основі методу лежить ампліфікація (багаторазове множення, синтез) специфічного для даного виду збудника фрагмента ДНК. Синтезується в ході ПЛР продукт можна детектувати різними способами. Одним з найпростіших, ефективних і поширених способів є електрофорез. Існують і інші методи, що дозволяють проаналізувати утворюється в результаті реакції ампліфікації продукт. До числа таких методів слід віднести рідинну хроматографію і мас-спектроскопію.
По суті, специфічність ПЛР визначається праймерами і становить 96-100%. Такий високий показник обумовлений тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється унікальний, характерний тільки для даного виду збудника фрагмент ДНК. Однак можливий невеликий відсоток хибнопозитивних реакцій, пов'язаних насамперед з перехресно-реагіруемимі антигенами, які можуть бути присутніми в досліджуваному матеріалі, а також технічними похибками, інгібіторами реакцій і т.д.
До існуючих модифікацій ПЛР відносять:
1. Зворотна транскриптаза ПЛР (ЗТ-ПЛР). У ряді випадків механізм простий ПЛР не придатний для ідентифікації РНК. Разом з тим добре відомо, що геноми багатьох вірусів складаються з молекул РНК, і внаслідок цього ідентифікація РНК-вірусів, таких як ВІЛ, представляється актуальним завданням. ОТ-ПЦР дозволяє визначати РНК-віруси.
2. Мультіпраймерная ПЛР здійснює процес коампліфікаціі декількох ДНК-матриць в одній реакційної середовищі з використанням декількох пар праймерів, що дозволяє проводити скринінг за кількома інфекційних збудників, визначати одночасно наявність в біопробі комплексу факторів вірулентності і резистентності до антибактеріальних і противірусних препаратів.
3. Гніздова ПЛР є однією з найбільш поширених і високочутливих модифікацій методу ПЛР. У методі використовується дві пари праймерів з послідовним визначенням специфічного фрагмента ДНК.
4. Метод in situ (IS-ПЛР) на відміну від звичайної ПЛР дозволяє не тільки специфічно ампліфікувати якусь послідовність ДНК, а й локалізувати її всередині клітини. Така здатність методу IS-ПЛР робить його неоціненним як в дослідженні латентних вірусних інфекцій і експресії генів в клітці, так і в оцінці ефективності нових лікарських засобів на клітинному і молекулярному рівнях.
Крім ПЛР, до ампліфікаціонних технологій відносять лігазну ланцюгову реакцію, яка широко використовується в діагностиці туберкульозу та деяких інших інфекційних агентів, що містять ДНК; амплификацию з витісненням ланцюга (SDA), реакції опосередкованої ампліфікації (NASA, NAS, 3SR).
Крім цих методів, використовуваних для ампліфікації ДНК-матриці, необхідно виділити методи гібридизації ДНК (тобто взаємодії комплементарних ланцюгів нуклеїнових кислот). У цих методах використовуються специфічні зонди, які з'єднані з субстратом або ферментом. В результаті відбувається багаторазове посилення утворюється сигналу, що реєструється тим чи іншим способом в ході визначення. До числа таких методик слід віднести метод «розгалуженої» ДНК (bDNA), заснований на гібридизації вихідної матриці з розгалуженою пробою, що містить кілька реакційно-здатних груп, що беруть участь в процесі детекції. Крім того, широко використовується для скринінгу деяких інфекційних агентів, таких як вірус папіломи людини, хламідій, ЦМВ, метод імунологічного захоплення гібрида ДНК / РНК з подальшою імуннохімічної детекцией.
Для цілей практичної ДНК-діагносткі, крім перерахованих вище методик, застосовуються також і інші технології, що дозволяють вирішити проблему встановлення характерних властивостей біооб'єкту, наприклад, його приналежність до певного штаму, наявність факторів вірулентності і т.д. До них відносять ДНК-чіпи і оптичні біосенсори. Технологія ДНК-чипів заснована на гібридизації невідомої нуклеотидноїпослідовності з розташованими в певному порядку відомими ДНК-послідовностями, іммобілізованими на поверхні скла або кремнію (ДНК-чіп) з подальшою детекцією. Однак на сьогоднішній день нуклеотидних послідовність більшості геномів розшифровано. Отже, то кількість інформації про генах індивідуального організму, яке можна закласти в ДНК-чіп, обмежена, що, в свою чергу, перешкоджає більш широкому застосуванню методів ДНК-чипів. Оптичні біосенсори засновані на ДНК-чіпах, але є відкритими системами, що дозволяють проводити спостереження в реальному режимі часу, що залишає дослідникам більше можливостей для маніпуляцій, вивчення і аналізу цікавлять генів.
Для методів ДНК-діагностики, зокрема ПЛР, найбільш раціональним і ефективним є їх застосування для виявлення мікроорганізмів, важко культивованих в лабораторних умовах, атипових форм бактерій, а також внутрішньоклітинних паразитів і мікроорганізмів, здатних тривалий час персистувати в організмі господаря без клінічних симптомів. Особливе місце в цьому ряду займають мікобактерії туберкульозу, деякі віруси, а також пріони.
