1 Златник Є.Ю. 1 Ситковская А.О. 1 Шульгіна О.Г. 1 Бондаренко Є.С. 1 Золотарьова О.І. 1 Гречкин Ф.Н. 1 Харагезов Д.А. 1 Каймакчі Д.О. 1
1 ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» Міністерства охорони здоров'я Росії
Проведено експериментальне вивчення впливу введення вакцинного штаму вірусу хвороби Ньюкасла на зростання перевівной пухлини карциноми Герена, тривалість життя і показники клітинного імунітету щурів-пухлиноносіїв. Робота виконана на 19 білих безпородних щурах-самцях з перевівной карциномою Герена. Вірус-вакцину вводили в разової дозі 5000 прівівних доз паратуморально 2 рази в тиждень, всього 4 рази: 1-й групі щурів введення починали через 1 день після перевивання пухлини, 2-й групі - за тиждень до перевивання. У периферичної крові, зібраної з стегнової вени тварин, визначали субпопуляційний складу лімфоцитів 2 рази в тиждень протягом двох тижнів після закінчення введення вірусу 2-й групі. Відносна кількість T- і В-лімфоцитів досліджували методом проточної цитофлюориметрії. Результати дозволили встановити відмінності характеру імунологічних змін, що розвиваються у щурів-пухлиноносіїв, в залежності від часу введення вірусу по відношенню до моменту перевивання пухлини і їх можливу значущість для отримання профілактичного ефекту на розвиток перевівной пухлини у деяких тварин. Вірус хвороби Ньюкасла в ранні терміни після введення викликає виражене підвищення рівня Т-клітин з маркером ранньої активації при зниженні рівня CD3 + CD8 + клітин у тварин ще до перевивання їм пухлини Герена, а після перевивання у них відзначалися більш високі рівні CD3 + CD4 + лімфоцитів у порівнянні з іншими групами. У контрольних тварин в усі терміни дослідження спостерігалося найбільш високий вміст CD3 + CD8 + і найбільш низьке CD3 + CD25 + клітин.
вірус хвороби ньюкасла
онколізіс
лімфоцити
1. Ottolino-Perry K., Diallo JS, Lichty BD, Bell JC, McCart JA Intelligent design: combination therapy with oncolytic viruses // Mol Ther. - 2010. - V. 18, № 2. - P. 251-263.
2. Yamamoto M., Curiel DT Current Issues and Future Directions of Oncolytic Adenoviruses // Molecular Therapy. - 2010. - V. 18, № 2. - P. 243-250.
3. Святченко В.А., Тарасова М.В., Нетесов С.В. та ін. онколітичних аденовіруси в терапії злоякісних новоутворень: сучасний стан і перспективи // Молекулярна біологія. - 2012. - Т. 46. - С. 556-569.
4. Goetz C., Gromeier M. Preparing an oncolytic poliovirus recombinant for clinical application against glioblastoma multiforme // Cytokine Growth Factor Rev. - 2010. - V. 21. - P. 197-203.
5. Rudin CM, Poirier JT, Senzer NN, Stephenson J.Jr., Loesch D., Burroughs KD, Reddy PS, Hann CL, Hallenbeck PL Phase I clinical study of Seneca Valley Virus (SVV-001), a replicationcompetent picornavirus, in advanced solid tumors with neuroendocrine features // Clin. Cancer. Res. - 2011. - V. 17. - P. 888-895.
6. Israelsson S., Jonsson N., Gullberg M., Lindberg AM Cytolytic replication of echoviruses in colon cancer cell lines // Virology Journal. - 2011. - V. 8. - P. 473.
7. Skelding KA, Barry RD, Shafren DR Enhanced oncolysis mediated by Coxsackievirus A21 in combination with doxorubicin hydrochloride // Invest New Drugs. - 2012. - V. 30, № 2. - P. 568-81.
8. Кешелава В.В., Добровольська Н.Ю., Подільська М.В., Гармарнік Т.В. Результати дослідження онколітичних вірусу хвороби Ньюкасла в неоад'ювантної терапії раку молочної залози за 3-річний період спостереження // Вісник РНЦРР. - 2010. - № 10. - С.1-12.
9. Fournier P., Schirrmacher V. Oncolytic Newcastle Disease Virus as Cutting Edge between Tumor and Host // Biology. - 2013. - V. 2, № 3. - P. 936-975.
10. Laurie SA, Bell JC, Atkins HL, Roach J., Bamat MK, O'Neil JD, Roberts MS, Groene WS, Lorence RM A Phase 1 Clinical Study of Intravenous Administration of PV701, an Oncolytic Virus, Using Two-Step Desensitization // Clin. Cancer. Res. - 2006. - V. 12, № 8. - Р. 2555-2562.
11. Liang W., Wang H., Sun TM., Et al. Application of autologous tumor cell vaccine and NDV vaccine in treatment of tumors of digestive traet // World Journal of Gastroenterology. - 2003. - V. 9, № 3. - P. 495-498.
12. Юрченко К.С., Губанова Н.В., Шестопалова Л.В., Щелканов М.Ю., Шестопалов А.М. Онколітичних властивості вірусу хвороби Ньюкасла // Тихоокеанський медичний журнал. - 2015. - № 3. - С. 14-18.
13. Schirrmacher V. Immunobiology of Newcastle Disease Virus and Its Use for Prophylactic Vaccination in Poultry and as Adjuvant for Therapeutic Vaccination in Cancer Patients // International Journal of Molecular Sciences. - 2017. - V. 18, № 5. - P. 1103.
В даний час для біотерапії пухлин вважається багатообіцяючим поєднання стратегій, спрямованих як на руйнування пухлинних клітин, так і на індукцію імунної відповіді проти них шляхом активації вродженого і адаптивного імунітету. Перспективною в цьому плані є онколітичних віротерапії (ОВ) з використанням непатогенних для людини вірусів, вибірково накопичуються в пухлинних клітинах. Стимуляція довгострокових протипухлинних імунних реакцій в організмі пухлиноносія вважається важливим компонентом індукції протипухлинного ефекту при проведенні віротерапії, яка може стати основою нового підходу до лікування раку; можливо, в поєднанні зі стандартною терапією [1].
При виборі ОВ для розробки біотерапевтичних продуктів принциповим моментом є їх непатогенних для людини. Першими офіційно дозволеними вірусними протипухлинними препаратами стали генномодифіковані штами аденовірусу людини з підвищеною вибірковістю дії на пухлинні клітини [2, 3]. Крім них запропоновані ще деякі онколітичних віруси, які проходять клінічні випробування, такі як пікорнавіруси пологів: polio- [4], сіні-SVV [5]; ентеровіруси ECHO [6] і Коксакі А21 [7]. Однак найбільш привабливими в якості протипухлинних препаратів є онкотропние віруси тварин, до яких у людини немає придбаного в дитинстві імунітету (віруси хвороби Ньюкасла, ентеровіруси, парвовіруси тварин, вірус везикулярного стоматиту та поксвирусов: осповакціни і віспи птахів) [8]. Одними з перспективних представляються віруси сімейства Paramyxoviridae, зокрема вірус хвороби Ньюкасла (ВСН), який не є патогенним для людини [9] і володіє онколітичних і імуностимулюючу дію.
У США була проведена I фаза клінічних випробувань штаму PV701 ВБН. У цьому дослідженні брали участь 79 пацієнтів з різними прогресуючими онкологічними захворюваннями, яким не допомагала традиційна терапія. У деяких пацієнтів під дією внутрішньовенного введення PV701 спостерігався розвиток часткової відповіді на лікування [10]. Liang і співавт. (2003) повідомляли про великому дослідженні, в якому терапію пухлин шлунково-кишкового тракту проводили вакциною з аутологічних пухлинних клітин, модифікованих нелітіческім штамом La Sota ВБН. Це була III фаза дослідження, в якій порівнювали 310 пацієнтів з резецированной колоректальний рак I-IV стадій і проведеної імунотерапії з 257 пацієнтами, які отримували тільки хірургічне лікування. Медіана загальної виживаності в групі з вакцинацією становила понад 7 років в порівнянні з 4,46 роками в групі тільки з резекцією. Дані були статистично значущими [11].
В останні роки запропоновано ряд препаратів на основі вірусів (Рігвір, Канцеролізін, Онкорін); дослідження з відбору та генетичної модифікації ОВ з метою посилення їх протипухлинних властивостей тривають.
Мета дослідження. Експериментальне вивчення впливу введення вакцинного штаму ВСН на зростання перевівной пухлини карциноми Герена, тривалість життя і показники клітинного імунітету щурів-пухлиноносіїв.
Матеріал і методи дослідження. У роботі використаний препарат «Вакцина проти ньюкаслської хвороби (НБ) жива суха (штам Ла-Сота)».
Робота виконана на 19 білих безпородних щурах-самцях. Для індукції пухлинного процесу тваринам підшкірно перевивали карцинома Герена. Вірус-вакцину ВБН вводили в разової дозі 5000 прівівних доз (1 флакон) паратуморально, 2 рази на тиждень, всього 4 рази: 1-й групі щурів введення починали через 1 день після перевивання пухлини, 2-й групі - за тиждень до перевивання. Тваринам контрольної групи підшкірно вводили фізіологічний розчин. У 1-й і 2-й групах було по 7 тварин, в 3-й (контрольній) - 5 щурів. Всі процедури введення препарату фіксувалися в листі введення.
Спостереження за тваринами і виміри пухлини з обчисленням її обсягу проводили щодня, фіксуючи результат в протоколі експерименту. Відомості про загиблих тварин відзначали в протоколі.
Правові та етичні норми утримання та використання тварин дотримувалися відповідно до Європейської конвенції із захисту хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986).
У периферичної крові, зібраної з стегнової вени тварин, визначали субпопуляційний складу лімфоцитів 2 рази в тиждень протягом двох тижнів після закінчення введення вірусу другої групи. Відносне (відсоткове) кількість Т- і В-лімфоцитів (CD3 +, CD4 +, CD8 +, CD25 +, CD45RA + клітин) досліджували методом проточної цитофлюориметрії за допомогою моноклональних антитіл (МАТ) фірми BD Pharmingen Rat T / B / NK Cell Cocktail, BD Pharmingen Rat Activated T Lymphocyte, BD Pharmingen Rat T Lymphocyte Cocktail за методикою, рекомендованою виробником.
Інтерпретація результатів здійснювалася відповідно до стандартів іммунофенотіпірованія і спеціально розробленим алгоритмам.
Результати дослідження та їх обговорення. Як видно з малюнка 1, у щурів 2-ї групи з введенням ВБН до перевивання відзначено менший обсяг пухлини в порівнянні з тими, кому ВБН вводили після перевивання карциноми Герена; відмінності реєструвалися протягом 6 тижнів спостереження, проте не досягали статистичної достовірності внаслідок широкої індивідуальної варіабельності всередині кожної з порівнюваних груп.
Мал. 1. Середні обсяги пухлини у щурів 2-й і 1-й досвідчених груп, які отримували ВБН.
Ось Х - тижні після перевивання; Ось Y - обсяг пухлини (см3)
Щури 2-ї групи, яким введення ВБН починали до перевивання, загинули на 21-й, 28-й, 37-й, 57-й дні після неї; середня тривалість життя становила 35,8 ± 10,1 днів. Щури 1-ї групи, яким ВБН вводили після перевивання пухлини, загинули на 29-45-й дні після перевивання, середня тривалість життя становить 34,0 ± 2,1 дня.
Мал. 2. Загальна виживаність щурів 1-й і 2-ї груп, які отримували ВСН
Як видно з малюнка 2, відмінності загальної виживаності щурів в залежності від часу введення ВБН були статистично недостовірні; їх тривалість життя після перевивання не відрізнялася і від контролю (таблиця). Однак на відміну від щурів, яким ВБН вводили після перевивання пухлини Герена, серед тварин, які отримували ВБН до перевивання, були такі, у яких пухлина не перев або регресувати на ранніх термінах (2-3 тижні після перевивання). Таких щурів було 3 з 7, їх не враховували при розрахунку тривалості життя, оскільки вони живі більше 6 місяців. У 1-й групі таких щурів не було, пухлина розвинулася у всіх 7 тварин і не регресувати в жодного (таблиця).
Динаміка зростання перещеплюваної карциноми Герена і тривалість життя щурів досвідчених і контрольної груп
Групи щурів
Обсяг пухлини (см3)
Число тих, що вижили тварин
Тривалість життя після перевивання (дні)
1 місяць
1,5 місяця
2 місяці
1 місяць
1,5 місяця
2 місяці
1
51,4
70
-
7/7
4/7
0/7
34,0 ± 2,1
2
19,5
25,4
-
5/7
4/7
3/7
35,8 ± 10,1
3
78,7
93,9
-
4/5
2/5
0/5
37,2 ± 6,2
Результати імунологічних досліджень, проведених у тварин, які отримували ВБН, і контрольних в динаміці спостереження, представлені на малюнку 3.
Мал. 3. Рівні CD3 + CD4 + (А), CD3 + CD8 + (Б), CD3 + CD25 + (В), CD45RA + (Г) в динаміці спостереження у щурів після перевивання карциноми Герена. Ось Y -%
Як видно з малюнка 3А, рівень CD3 + CD4 + лімфоцитів в динаміці проведення експерименту в контрольній та в 1-й дослідній групах знижувався, а в 2-й дослідній (з попереднім введенням ВБН) не мав статистично значущих відмінностей від вихідних і зростав у порівнянні з контрольної (3-й) і 1-ю групою. Так, через 3 тижні рівень CD3 + CD4 + у щурів 2-ї групи становив 42,0 ± 5,7%, а в контролі - 27,3 ± 2,3% (р <0,05); через 4 тижні відмінності зберігалися (38,7 ± 11 проти 18,5 ± 1,6%; р <0,05). У тварин 1-ї групи відбувалося статистично достовірне зниження цих лімфоцитів через 4 тижні (з 35,9 ± 4,5 до 20,6 ± 3,7%, р <0,05). Цікаво, що введення ВБН тваринам, яким пухлина ще не перевивали, що не викликало зміни рівня CD3 + CD4 +, на відміну від рівня CD3 + CD8 + клітин, кількість яких знижувався під впливом введення ВБН ще до перевивання пухлини (рис. 3Б).
Як видно з малюнка 3Б, після перевивання пухлини кількість CD3 + CD8 + виявилося максимальним в контрольній групі, особливо на 2-му тижні після перевивання. В цей термін, а також через 4 тижні воно статистично достовірно перевищувало рівні цих клітин у щурів обох дослідних груп (через 2 тижні 41,1 ± 7,0% проти 11,0 ± 2,4% в 1-й і 13,5 ± 2,5% у 2-й групі; через 4 тижні 22,1 ± 4,9% проти 11,6 ± 2,0% в 1-й і 11,3 ± 1,3% у 2-й групі; у всіх випадках р <0,05).
Як видно з малюнка 3В, введення ВБН викликає підвищення рівня активованих Т-клітин з маркером ранньої активації (CD25 +), який в подальшому після перевивання в обох дослідних групах змінювався хвилеподібно. Кількість цих клітин у контрольних тварин поступово зростала, хоча до 2-му тижні було статистично достовірно нижче, ніж в обох дослідних групах (0,78 ± 0,28% проти 2,91 ± 0,33% і 2,99 ± 0, 34% відповідно, р <0,05), а до 4-му тижні і не досягало значень, які спостерігаються у досвідчених щурів 1-ї групи (1,47 ± 0,3% і 2,79 ± 0,16% відповідно, р <0,05).
Як видно з малюнка 3Г, рівні В-лімфоцитів не змінюються після введення ВБН, проте через 2 тижні після перевивання пухлини у щурів 1-й і 2-ї груп вони перевищують контрольні показники в 2 рази, а потім знижуються до рівня контрольних тварин.
Комбінація імунотерапії і віротерапії пухлин передбачає їх синергізм, що включає ініціацію імунної відповіді на антигени вірусів, а також частково зруйнованих під дією онколітичних вірусів пухлинних клітин. Механізми цитопатичної дії ВБН пов'язані з індукцією апоптозу, апоптоз-опосередкованого некрозу, аутофагії і сінцітіеобразованіем. Хоча штам ВБН Ла-Сота і вважається нелітіческім, тобто не приводять до утворення синцития, у нього описаний такий механізм ушкодження пухлинних клітин, як індукція апоптозу [12], показаний in vitro, а його імуногенні властивості можуть бути використані для стимуляції протипухлинного відповіді [13].
У нашій роботі оцінка показників Т- і В-клітинної ланки у щурів продемонструвала, що введення ВБН до перевивання пухлини Герена викликає виражене підвищення рівня Т-лімфоцитів з маркером ранньої активації (CD3 + CD25 +) при зниженні рівня CD3 + CD8 + клітин. Ми припускаємо, що така підготовка дає можливість зберігати більш високі рівні CD3 + CD25 + і CD3 + CD4 + лімфоцитів при подальшій перевивку пухлини Герена в порівнянні не тільки з контрольними тваринами, але і з тими, кому пухлина перевивали раніше, ніж починали вводити ВБН. Відсутність зростання пухлини у частині тварин, які попередньо отримували ВБН, на наш погляд, пов'язано з отриманої стимуляцією Т-клітин, що зберігається і в динаміці спостереження. Введення вакцини проти ВБН здатне не тільки надавати профілактичну дію при застосуванні для імунізації проти бронхіту птахів, а й попереджати розвиток перещеплюваної пухлини, хоча останнім отримано і не у всіх тварин. Можливо, для досягнення більш повного ефекту слід комбінувати застосування ВБН з іншими методами протипухлинних впливів.
Висновок. Отже, показники Т- і В-клітинної ланки в досліджуваних групах щурів демонструють, що ВБН в ранні терміни після введення викликає виражене підвищення рівня Т-лімфоцитів з маркером ранньої активації при зниженні рівня CD3 + CD8 + клітин. При подальшій перевивку пухлини Герена таким тваринам відзначена стимуляція у них CD3 + CD4 + і CD3 + CD25 + лімфоцитів, на відміну від контрольних пацюків. Судячи з отриманих результатів, стимуляція Т-клітинної ланки імунної системи щурів за допомогою попереднього введення ВБН сприяє індукції у частині тварин протипухлинного ефекту у вигляді відсутності росту пухлини або її регресії в ранні терміни.
бібліографічна посилання
Златник Є.Ю., Ситковская А.О., Шульгіна О.Г., Бондаренко Є.С., Золотарьова О.І., Гречкин Ф.Н., Харагезов Д.А., Каймакчі Д.О. ВПЛИВ ВІРУСУ на хворобу Ньюкасла НА ПОКАЗНИКИ КЛІТИННОГО ІМУНІТЕТУ ЩУРІВ-пухлиноносіїв (ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ) // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2018. - № 4 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27948 (дата звернення: 27.06.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?
