Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

1. Зростання паразитів

1. Зростання trypomastigote форм Т. cruzi Береника і β-галактозидази, висловивши Tulahuen T. cruzi MHOM / CH / 00 C4 в мишачі клітини м'язи (L6) вирощують в Дульбекко мінімальний основний середовищі з 10% FSB, 100 МО / мл пеніциліну, 100 мкг / мл стрептоміцину і 250 нМ L-глутамін (рН 7,2), 5% CO 2 при 37 ° C. Вільне плавання trypomastigotes в надосадочной середовища були використані для зараження курячих яєць.
2. Зростання Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 акції виросли в DMEM з 20% ЕТС. Форма Lb промастіготи в експоненційної фазі росту використовували для інокуляції яєць 9.

2. Щеплення паразитів в запліднених курячих яєць

1. Інокулювати підвіски 100 т. Cruzi trypomastigotes в 10 мкл культурального середовища через 2-мм отвір в оболонці яйця на верхній повітряної камери стадііX запліднені яйця. Вторгнення і реплікації небезпечних паразитів в клітинах ембріона показано у відео S1. Контрольної групи є наступні: а) контроль курей, б) макет яйця контроль отримання 10 мкл культуральному середовищі, в) етап X запліднені яйця щеплених з підвіскою 100 promastigotes Lb в 10 мкл культурального середовища Т .. cruzi і Lb належать kinetoplastid сім'ї. Відповідно, ці найпростіші рости вільно в цитоплазмі або в паразітофорной вакуолі клітин господаря 10.
2. Ущільнення отвори липкою стрічкою.
3. Інкубуйте T. cruzi-інфіковані яйця і макет і неінфікованих контрольних проб в 37,5 ° C і 65% вологості протягом 21 днів.
4. Тримайте курчат, які вилуплюються в інкубаторі протягом 24 год, а потім при 32 ° C протягом трьох тижнів.

3. Отримання зразків для виділення ДНК

1. Мононуклеарів периферичної крові клітини були отримані від курей: а) вилупилися з T. cruzi щеплені яйця, б) контролю, в) отримання знущається 10 мкл культурального середовища, г) вилупився з яйця Lb щеплені, білі кров'яні клітини з курми, обробляються для екстракції ДНК відповідно до стандартного протоколу 11.
2. Витяг ДНК зі сперми також зібрані з птахів, і від безплідних ооцитів (<5 мм), зібраних від курей, що вилупилися з яєць щеплених з Т. cruzi, і курей, що вилупилися з яєць контроль 3, 4.
3. Витяг kDNA від Т. cruzi епімастігота форми і, крім того, з Lb promastigotes, як описано в іншому місці 9.

4. Праймери й зонди використано

Праймерів для ампліфікації ПЛР і теплові умови наведені в таблиці 1.

Зонди, які використовуються в Південній гібридизації плямою були:

1. Дикого типу minicircle (~ 1,4 кб) послідовностей пуріFied від Т. cruzi епімастігота форм;
2. Minicircle фрагментів (362 б.п.), отриманий НДІ я дайджести дикого kDNA;
3. Ядерна ДНК (nDNA) повторювані послідовності (188 б.п.), отриманий посилення паразита ДНК з Tcz1 / 2 праймерів. Зонди були очищені від 1% агарозному гелі 3.
4. Дикого типу minicircle (~ 0,820 кб) послідовностей з Lb promastigotes.

5. ПЛР-аналіз

1. Виконайте стандартну процедуру ПЛР з геномної ДНК від інфікованих курчат і неінфікованих управління і знущатися над використанням T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 і kDNA s35 / s36 13 праймерів. Крім того, працювати ПЛР з геномної ДНК від курей вилупилися з Lb-інфіковані яйця допомогою найпростіших конкретних Lb3 і Lb5 праймерів (табл. 1).
2. Зробити реакційної суміші з 100 нг ДНК-матриці, 0,4 мкМ кожної пари праймерів, 2 U Taq ДНК-полімерази, 0,2 мМ дНТФ і 1,5 мМ MgCl
3. Встановіть програму для термоциклері 95 ° C протягом 5 хв, 30 циклів 30 секунд при 95 ° C / 30 сек при 68 ° С / 1 хв при 72 ° С, 5 хв остаточне розширення до охолодження.
4. Аналіз продуктів ампліфікації в 1,3% агарозному гелі, який передається на позитивно заряджених нейлонову мембрану (GE Life Sciences) в лужної метод гібридизації з зондами позначені [α-32 P] дАТФ використанням випадкового праймера маркування Kit (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія).

6. Геномна Південної блотом

1. Використовуйте Мбо я і / або Eco RI (Invitrogen) ферменти, які роблять одне скорочення minicircles інтегрована в ДНК зразків тканин тіла.
2. Дайджест ДНК з неінфікованих курей контролю, а також кури вилупився з яйця щеплених з небезпечної T. cruzi форми.
3. Тема дайджести ДНК T. cruzi ііз зразків курячого тест для електрофорезу в 0,8% агарозному гелі при 50 Протягом ночі при 4 ° C.
4. Передача розділених груп ДНК позитивно зарядженими нейлонову мембрану.
5. Гібридизації ДНК смуги з написом радіо kDNA зонда.
6. Вимийте мембрани двічі протягом 15 хв при 65 ° C з 2X SSC і 0,1% SDS, двічі протягом 15 хв при 65 ° С кожної 0,2 x SSC і 0,1% SDS і авторадиограмм для різних періодів часу.

7. Цільові прем'єр-ХВОСТ-PCR

1. Отримати посилення kDNA minicircle інтегруватися в геном курячого модифікованим Хвіст-PCR метод, який поєднує в собі kDNA грунтовки з конкретними грунтовка встановлює 2 в трьох ходити в циклах ПЛР, як показано на малюнку 1.
2. Первинний цикл: кожна реакція включає в себе 200 нг ДНК-матриці, 2,5 мМ MgCl 2 та 0,4 мкМ kDNA праймерів (S34 або S67), 0,2 дНТФ мм, 2,5 U Taq Platinum (Invitrogen, Карлові Вари , CА). Використовуйте kDNA грунтовки в поєднанні з 0,04 мкМ рр праймерів (gg1 в Gg6, таблиця 1), окремо. Встановіть температуру з 57,9 до 60,1 ° С протягом kDNA грунтовки і з 59,9 до 65,6 ° C для CR-1 грунтовки. Зверніть увагу, що ці температури вище, ніж у (~ 45 ° C), необхідних для довільного виродженого праймери, які використовуються в хвіст-PCR 10. Використання температури і цикли (MyCycle термоциклері, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), описаної в попередній статті 3.
3. Вторинний цикл: Розвести продуктів ПЛР з основною цикл 1:40 (об / об) в воді. kDNA грунтовки S35 і S35 антисмислових замінили попередні, разом з тими ж праймерами рр.
4. Третинного циклу: розвести PCR продуктів з вторинної циклу 1:10 (обсяг / обсяг) у воді і об'єднати рр грунтовки з S67 або S36 антисмислових окремо.
5. Клонування ПЛР третинного циклу продукції: Clone безпосередньо в pGEM T легко вектор (Promega, Madison, WI) продукції, що останнє посилення гібридизації з kDNA зонда.
6. Виберіть клонів шляхом гібридизації з зондом kDNA і послідовності.
7. Перевірка tpTAIL-ПЛР в суміші 300 мкг kDNA від Т. cruzi з 200 нг ДНК від контролю птахів ніколи не піддається kDNA. Температури і посилення циклів такі ж використовуються для ДНК-тесту птахів.

8. Хвороба Шагаса клінічних проявів

1. Моніторинг росту і розвитку курчат вилупилися з T. cruzi інфіковані яйця і здорових пташенят з незаражених яєць в день смертність і щотижня для проявів хвороби.
2. Виявлення клінічних відхилень у цих курей (рис. 2) і зробити електрокардіограф (ЕКГ) записи для оцінки електричної осі, ЧСС і аритмії 3.
3. Тема kDNA-мутував і контролює курей щомісяця ЕКГ розширеної шлуночка ООНipolar призводить AVF (ліва нога), AVL (ліва рука) і AVR (права рука), і оцінити відхилення середньої електричної осі вліво, що наводить на думку про розширення серця 3.

9. Патологія і імунохімічних аналізів

1. Серце записи і індекси маси тіла після смерті природних kDNA мутував курей (рис. 3). Отримати індекси також для управління курей одного і того ж віку і статі.
2. Візьміть розділи з серця, стравоходу, кишечника, скелетних м'язах, легенів, печінки і нирок.
3. Виправити тканини в буферному 10% формаліну (рН 7,4), вставляти в парафін і скоротити до 4 мкм розділи гематоксилін-еозином (HE) фарбування і гістологічного аналізу (рис. 3).
4. Урожай і ділити навпіл тканин ембріонів вилупився з яйця паразитів, щеплені з виразом β-галактозидази, і відповідно до X-Гал-пляма 9.
5. Закріпіть другу половину тканини ембріона в 10% формаліні, рН 7,4 і діяти, як в кроці 9.3.
6. Вирізати 4μm тонкий парафін тканини розділ і встановити на скло для мікроскопічного дослідження.
7. Інкубуйте розділи, що відображає X-Gal забарвлених синьою клітини людини chagasic антисироватки (1 1024 розведення) проти анти-Т cruzi антигену.
8. Вимийте розділи миттю з PBS, 7,4 рН, 5 хв.
9. Пляма синій клітин в ембріон тканин другий інкубації з флуоресцеїн-сполучених кролячих анти-IgG людини.
10. Вимийте ділянки з PBS (крок 8), кріплення з покривним і спостерігати синє світло клітини-зеленим на розгляд в УФ-світлі при 502 нм, 200х збільшення, для colocalizing T. cruzi в зародковому стані клітин.

10. Фенотип клітини імунної системи, в серце поразки

1. Фенотип клітини імунної системи ефекторів в зрізах тканини серця від kDNA-позитивних і від контролю kDNA-негативні курей.
2. Помістіть слайди ссрез тканини в парафін при температурі 65 ° С протягом 30 хв, щоб розплавити віск до подання в чотирьох миє в 100% до 70% ксилолу, а потім в абсолютному етанолі PBS протягом 5 хвилин кожен.
3. Промийте слайдів в дистильовану воду, повітря сухе, і звертатися з конкретними моноклональних антитіл (флуоресцеїн або R-фікоеритрин кон'югованих моноклональних антитіл), отримані з SouthernBiotech, Бірмінгем, Алабама.
   1. Використовуйте мишу, анти-курка-Бу-1 (Bu-1 і Ві-1 алелей б, г-н 70-75 кДа) Маб AV20 визнати мономорфних детермінант на антигенів клітини інбредних курей.
   2. Використовуйте мишу, анти-CD45 курка, Ig изотипа IgM1 κ відносяться до курячим тимуса лінії клітин (г-н від 190 до 215 кДа варіант).
   3. Використовуйте мишу, анти-курка TCRγδ + (Г-н 90-кДа гетеродімер) Маб, специфічні для тимус залежних CD8α + Т-клітин.
   4. Використовуйте мишу, анти-курка Маб CD8, специфічні для курячих α ланцюг (г-н 34 кДа) визнати йелектронной CD8 клітин в тимоцитов, селезінки, серця та інших тканин.
   5. Використовуйте мишу, анти-курка KuL01 виключно визнати, моноцити / макрофаги фагоцитарної системи.
4. Вимийте слайд три рази з 0,1 М PBS, рН 7,4, 5 хв після інкубації з конкретними анти-фенотип антитіл протягом 90 хв у вологій камері.
5. Зберіть слайд з буфером гліцерин для іспиту з флуоресцентним мікроскопом з випусканням фільтр з довжиною хвилі 567 і 502 нм, відповідно, для виявлення червоного і зеленого флуоресцентного мічених клітин (рис. 4).

11. Аналіз даних

1. Використання бази даних курячого генома ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) Для аналізу BLASTN послідовності.
2. Використовуйте CLUSTALW вирівнювання для визначення електронної значення балів.
3. Застосовувати Г.І.RI повторити алгоритм маскування цензура ( http://girinst.org/censor/index.php ) Для локалізації різних класів повторюється в химерних послідовностей.
4. Застосовувати Kinetoplastid вставки і видалення послідовності Search Tool (KISS) для виявлення потенційних gRNAs в послідовності kDNA, за допомогою WU-BLASTN модифікованих-матрицею 3.
5. Використання Т. cruzi послідовності http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas шукати в gRNAs в kDNA господаря химери ДНК. 11.6) Використання Стьюдента і Kolmorov-Смирнова випробування, відповідно, для виявлення істотних відмінностей між відхилень електричної осі, а також між серцем / тіло показники ваги, отримані в експериментальній і контрольній груп, а також для виявлення смертності співвідношення значущих відмінностей між групами курчат вилупилися від Т. cruzi яnoculated яйця і від контролю.

12. Представник Результати

Щеплення 100 небезпечних Т. cruzi trypomastigotes в повітрі камери запліднені яйця курячі не суттєво скоротити відносини курчат живцем. Близько 60% здорових курчат люк і 40% можуть піддаватися зрідження ембріона або зародка смерті вилуплення. Що залишилися в живих курчат зберегти послідовність kDNA minicircle інтегруватися в геном. Проте, очікується, що деякі пташенята загинуть з кардіомегалія і невдачі протягом декількох тижнів після вилуплення. Решта курчат зросте до зовні здорових дорослих людей. На всіх етапах життя ДНК, виділеної з крові мононуклеарів дасть ПЛР-ампліфікації kDNA, але не nDNA. Цільових прем'єр-ХВОСТ-PCR 3, 4 продуктів, які клонуються і послідовність покаже kDNA minicircles інтегровані в основному в регіонах кодування macrochromosomes 1 до 5. Кури відображення декількох kDNA яntegrations в генах, що кодують зростання і диференціювання клітин, імунних факторів системи регуляції і репарації ДНК є кандидатами для проходження відмова від самостійного тканинах (рис. 3). Наприклад, курка показує kDNA мутації з розривом в гені дистрофина (рис. 5), що кодують білок, який пов'язує цитоскелету до клітинної мембрани, є кандидатом на розвиток аутоімунних запальних кардіоміопатії і невдачі.

Ці модифікації генома не бачив курчат з Lb інфікованих яєць. Існують відмінності між T. cruzi і Lb kDNA minicircles, Т. cruzi до ДНК minicircle середньому 1,4 кб структуру з чотирма змінними області (VR) перемежовуються консервативних регіонів (CR), кожен представляє CSB1, CSB2 і CSB3 регіонів, в яких CA- багаті ДНК вигнуті розглядаються конкретні сайти для ініціації реплікації, транскрипції, рекомбінації, так і для горизонтальної передачі ДНК Lb kDNA minicircle (середній розмір 820 б.п.) містить одну CR слід VR. CR зберіг CSB1 (GGGCGT) і CSB2 (CCCCGTTC) блоки, які відрізняються від тих, в Т. cruzi minicircles 15, 16 і 17. З огляду на, що Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) показує 12 НТС гомології T. cruzi можна припустити, що або Lb kDNA minicircle інтегрується в більш низьких частот, які можуть бути не видно на методи, використовувані, або що він може, ймовірно, не інтегруються в геном курки взагалі.

ГрунтовкаДНК-мішеніПослідовністьТ *

S 34 Т. cruzi kDNA 5 'ACA ВЗГ ACC ВЗГ УВС ДАА CC 3' 57,9 S 67 Т. cruzi kDNA 5 'ГГТ ТТТ GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3 "60,1 S 35 Т. cruzi kDNA 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' 59,4 S 36 Т. cruzi kDNA 5 'ГГТ TCG АТТ ГТТ ГГТ GGG G 3 "57,9 Lb3 Lb kDNA 5 'GGG GTT ГГТ GTA ATA TAG TGG G 3" 55,9 Lb5 Lb kDNA 5' CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3 "61,4 GG 1 Gallus Gallus 5 'AGC TGA TCC ТАА CAG AGG AGC 3 '60,1 GG2 Г. Gallus 5' КТГ AGC СТС ТГКТТТ ДАА 3 '56,8 Gg3 Г. Gallus 5' TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3 "60,1 GG4 Г. Gallus 3 'GCT КТГ CCT TTA GGA TCA GCT 5 '64,2 Gg5 Г. Gallus 3' AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5 '62,3 Gg6 Г. Gallus 3' КТГ TTA GCA TGA GGC TTC ACA 5 '60,4

Таблиця 1. Прості, використовувані в ПЛР уточненнями. * Т = середня температура відпалу ° C.

Малюнок 1. Р Хвіст-PCR стратегія використовується для виявлення Trypanosoma cruzi kDNA інтеграції в Gallus Gallus генома. А) химерних послідовностей з фрагментом kDNA minicircle консервативних (синій) і змінної (блакитний) регіонів інтегрована в осередку NW_001471687.1 в хромосомі 4 (AY237306) з курячого генома 10 (зелений) був використаний для отримання приймаючої конкретного набору праймерів (gg1 в Gg6) . Б) р Хвіст-PCR ампліфікації були розпочаті (первинний цикл) з відпалу minicircle конкретних S34 або S67 грунтовки в поєднанні з курячим конкретних gg1 в Gg6 праймерів. Скоригований чистий продуктів, що надаються шаблон для вторинного циклу з S35 (сенс / антисмислового) грунтовки і комбінації праймерів рр. У третинному циклі розведення вторинні продукти піддавали ампліфікації kDNA S36 або S67 грунтовки антисмислових в поєднанні з ґрунтовкою Гг с. C) Ці продукти ампліфікації розділяли в 1% агарозному гелі і передані в нейлонової оболонкою, гібридизації з зондом конкретних kDNA. Зразки показує позитивний сигнал були використані для клонування, щоб визначити точку інтеграції. Комбінації kDNA і цільових gg1 в Gg6 показані у верхній частині гелю. Послідовних реакцій ПЛР посилення цільової kDNA господаря ДНК з kDNA minicircles (синій) і пташиний послідовність (зелений). (Передруковано з PLoS забутих тропічних хвороб 3).

Малюнок 2. Клінічні прояви порушення функції серця в 9-місячний курча генетично модифіковані інтеграції мітохондріальної kDNA minicircle від Т. cruzi. Бідна киснем кров мітохондріальної kDNA мутував курка показує фіолетовий контрастів гребінь з яскраво-червоними гребінь управління 9-місячного chickeя вільна від пошкодження серця. (За матеріалами PLoS забутих тропічних хвороб 3).

Малюнок 3. Гросса і мікроскопічних патології Gallus Gallus з мутаціями kDNA. А) Кардіомегалія в 9-місячний курку, яка померла від серцевої недостатності. Б) Управління серце від неінфікованих 9-місячного курки. C) Відмова від клітини-мішені серця цитотоксичних лімфоцитів: мінімальна одиниця відмову з лізису клітин-мішеней імунної лімфоцитів зображений (коло). D) Управління серце гістології (зі змінами по PLoS забутих тропічних хвороб 3).

Малюнок 4. іммуноцітохіміческіе аналіз клітини імунної системи проникають в серце kDNA-мутував курка показано на малюнку 3. А) CD45 + лімфоцитів визначені (стрілки) в серце леsions по фікоеритрин-мічених моноклональних антитіл. B) CD8 + γδ імунних лімфоцитів (стрілки), що беруть участь в серйозні руйнування серця. С), рясні CD8α + Т-клітин, присутніх в важкі ураження серця з лизирует клітини. Вставки показують відсутність клітин імунної системи в боротьбі неінфікованих серце курки (зі змінами по PLoS забутих тропічних хвороб 3).

Малюнок 5. Шагаса, як розширені запальних кардіоміопатії в F2 потомство з kDNA інтеграції в гені дистрофина. А) Розширені серце в 10-місячний курча займає більшу частину грудної порожнини (серце вага = 16 г). Б) темний круглий мононуклеарних інфільтратів і руйнує клітини міокарда kDNA-мутував курки. C) Нормальний розмір серця (вагою 7 г) на 10-місячний контроль курки. D) Нормальний гістології серця курячого управління. (За матеріалами PLoS забутих Tropic ін. Хвороб 3).

Малюнок 6. Порівняльна патологія в kDNA-мутував курку і в людській хвороби Шагаса. А) важкий міокардит та цільових лизирует клітини серця в kDNA-мутував курки. Б) Важкий міокардит та лізису клітини-мішені імунної лімфоцитів в разі серцево-судинних захворювань Шагаса. C) Відмова від серцевих клітин імунної лімфоцитів в kDNA-мутував курки. D) Відмова від серцевих клітин імунної лімфоцитів людини хворобою Шагаса. Забарвлення по гематоксиліном і еозином. (Із змінами по Memorias зробити Інституту Освальдо Круса, Ріо-де-Жанейро, 14).