1. Підготовка B. Сінна культур
- Прищепити клітини від -80 ° C запаси в 10 мл покадровой мікроскопії (TLM) середовища (62 мМ K 2 HPO 4, 44 мм KH 2 PO 4, 15 мМ (NH 4) 2 SO 4, 6,5 мМ цитрату натрію, 0 , 8 мм MgSO 4, 0,02% casamino кислоти, 27,8 мМ глюкози, 0,1 мМ L-триптофан, рН був встановлений в 7 за допомогою розчину КОН) з додаванням антибіотиків, якщо це необхідно.
- Рости клітини на ніч в струшування флаконів (30 ° C, 225 оборотів в хвилину).
- На наступний ранок, розвести 1:10 на клітинах підігрітого хімічно певному середовищі (МЧР) (62 мМ K 2 HPO 4, 44 мм KH 2 PO 4, 15 мМ (NH 4) 2 SO 4, 6,5 мМ цитрату натрію, 0 , 8 мМ MgSO 4, 2.2 мм глюкози, 2,1 мМ L-глутамінової кислоти, 6 мкМ L-триптофан, 7,5 мкМ MnCl 2, 0,15 х металів суміші (підготовка 50x MT суміш акції (посилання 8), який містить: 0,2 M MgCl 2, 70 мМ CaCl 2, 5 мМ MnCI 2, 0,1 мМ ZnCl 2, 0,2 мМ тіамін-гідрохлориду, 2 мМ HCl, 0,5 мМ FeCl 3 (додати останній)) без антибіотиків.
- Рости Б. Сінна клітини до середини експоненційної фазі (30 ° C, 225 оборотів в хвилину). Зазвичай це займає близько чотирьох годин. Важливо відзначити, що підготувати слайд агарозном за одну годину до клітини досягають середини експоненційної фази (див. Розділ 2).
- Виміряйте оптичну щільність культури на 600 нм (600) і розбавлених клітини приблизний 600 з 0,035 використання МЧР. Це гарантує, що OD одиночних клітин з відповідним відстанню виставляються на предметне скло мікроскопа для покадрового мікроскопії.
2. Підготовка мікроскопом зразка (також див. Малюнок 2)
За годину до клітини досягають середини експоненціальне зростання, підготувати скло мікроскопа наступним чином:
- Чистий дві предметні скельця мікроскопа (наприклад Кніттель Скло, 7,6 х 2,6 см) з 70% етанолу і води.
- Візьміть гена кадру (ABgene, 1,7 х 2,8 см) і обережно зніміть одну з пластикової плівки з генів кадр, не викликаючи розбирання пластикову кришку з іншого боку ген кадру.
- Прикріпити гена кадру в центрі одного з стекол, спочатку полегшення контактів на одній стороні, а потім керуватися кріплення залишилися генів рама з нігтем. Запобігання бульбашки повітря надаючи гена кадр скло.
- Використовуйте мікрохвильову піч, щоб розчинити 150 мг (1,5%) з високою роздільною здатністю легкоплавких агарози (Sigma) в 10 мл МЧР. Агарози повинна бути повністю розчиненого отримати мінімальну фону, необхідного для покадрового експериментів мікроскопії. При необхідності, доповнювати агарозном-CDM з індуктором або інших з'єднань, в цей час
- Передача 500 мкл теплою агарозном-МЧР в середині гена кадру. Переконайтеся, що вся територія, включаючи (кордонів) повністю покривається.
Наступні кроки (2.6 - 2.10) повинні бути проведені швидко, щоб запобігти надмірному висиханню агарозном-CDM. - Місце другого предметне скло на агарозном-CDM заповнені гена кадру. Намагайтеся уникати бульбашок повітря. Місце затиснутою слайдів в горизонтальному положенні протягом 45 хв при 4 ° С в холодильнику, щоб агарозном-CDM зміцнити в достатній мірі.
- Ретельно зісковзувати верхньої предметне скло. Використовуйте лезо, щоб вирізати агар смуги ~ 5 мм ширини в межах гена рама, на якій клітини будуть вирощуватися. Не більше трьох смуг можуть бути використані на слайд, розділених ~ 4 мм простору для обох сторін. Ці простору забезпечить повітрям, який має важливе значення для Б. Сінна зростання. Якщо чотири різні штами повинні бути виконані в строк, дві смужки можуть бути зроблені і різати навпіл, щоб результат в чотирьох маленьких квадратиків. Видаліть будь-які залишкові твердому середовищі.
- Обережно зніміть другий і останній пластикову кришку від гена кадру, щоб виставити липкою стороні гена кадру
- Навантаження одиночних камерах (з кроком 1,5) на твердому середовищі, не торкаючись його з піпетки чайові. Використовуйте 2,5 мкл для всієї смузі, або на 1 мкл для невеликої площі. Завжди починайте зверху агарозном майданчик і дозволяють розігнати рідина в рівній мірі про своє встановленому зростання області, повертаючи ковзати вгору і вниз. Слайд готовий, як тільки краю рідини стають гофрованими і рух рідини більше не видно при включенні слайда.
- Місце чисте предметне скло покривне скло (24 х 50 мм) на ген кадр з одного боку на іншу (щоб уникнути повітряних бульбашок). Забезпечити повне вкладення, застосовуючи тиск на обкладинці ковзання по ген рама з нігтем. Якщо покривне скло поміщається на клітини, не дозволяючи їм висохнути досить довго, то клітини мають тенденцію до зростання друг на друга під час експерименту. Також будьте обережні, щоб не чекати занадто довго, перш ніж застосовувати покривним склом, так як агарозном потім буде дуже сухе.
- Попередньо теплою слайд протягом 1 години при температурі 30 ° C. Якщо слайд Wульд безпосередньо бути поміщені в підігрітого екологічної палати (див. Крок 3.1) мікроскопа, коливання температури можуть викликати автофокусом проблеми в перші години експерименту.
3. Покадровий флуоресцентної мікроскопії (також див. Рисунок 3 і фільм 1)
- Попередньо теплою екологічної палати за часом (в наших руках, по крайней мере 2 години до початку експерименту) з метою запобігання автофокусом проблеми після початку експерименту. Час залежить від екологічної камера, використовувана, а також системи опалення та мікроскоп.
- Виберіть відповідну мету, фільтри і діхроічние дзеркала відповідно до ваших експериментальної установки. Для тривалих експериментів переконайтеся, що УФ-фільтр поміщається між джерелом світла і зразком. Також, за можливості, заблокувати деякі збуджуючого світла використанням нейтральні фільтри для мінімізації впливу.
Наступне обладнання (надається DeltaVision, Великобританія) була використана для покадрового мікроскопії експериментів опубліковані в де Йонг і ін. 2010 5. IX71 мікроскоп (Olympus), CoolSNAP HQ2 камери (Princeton Instruments), 300 Вт ксенонові джерело світла, яскравих 60x Мета поле (1 , 25 NA), GFP filterset (Chroma, порушення при 470/40 нм, емісія 525/50 нм), mCherry filterset (Chroma, порушення при 572/35 нм, емісія 632/60 нм). Автофокус проводили з використанням діаскопічній світла і використовуючи даний автофокусом рутини в Softworx програмного забезпечення Deltavision в. Слід зазначити, що Є в даний час ряд інших систем автофокусу, який також підходять такі як Zeiss Певні Фокус, Nikon досконала система фокусування і Фокус Leica адаптивного управління.
- Програма вашого експерименту відповідно до ваших експериментальної установки. Доцільно, щоб визначити кількість світла, необхідного для конкретних конструкцій, а також автофокусом параметри для інших покадровой мікроскопів або бактерій до фактичного експерименту. Більш короткі експозиції і меншу кількість збудливого світла дозволить звести до мінімуму відбілювання і фототоксичности. Використовуйте діаскопічній світла для рутинних автофокусом.
Наступні параметри були використані для покадрового мікроскопії експериментів опубліковані в де Йонг і ін. 2010 5. Знімки для перегляду фільмів були зроблені з інтервалом в 8 або 12 хвилин, використовуючи 10% APLLC Білий світлодіод і 0,05 с експозиції для яскравими картинками поле, 10% світло ксенону і 0,5 с експозиції для GFP виявлення, і 32% світло ксенону і 0,8 с експозиції для mCherry виявлення, відповідно. Вихідні дані були збережені з використанням softWoRx 3.6.0 (прикладної Presicion). Автофокус був запрограмований на 0,06 мкм кроки і загальний діапазон від 1,2 мкм.
- Місце підготовлених слайдів (розділ 2) в підігрітого екологічної палати мікроскоп і монітор наслідком однієї клітини в мікроколонія моношару при температурі 30 ° C.
Конкретні поради:
- Виберіть окремі клітини, які знаходяться в середині агар майданчик. Краї площадки агар висохнути легше. Магазин X, Y, Z позицію, використовуючи програмне забезпечення мікроскопа.
- Великий руху етап X, Y і Z напрямку може обурити агарози і, отже, перешкоджають ідентифікації клітин рутинної автофокусом. Загалом, щоб звести до мінімуму X, Y, Z рух, ми не вибрали більш ніж на 10 позицій в експерименті, навіть якщо слайд містить кілька штамів.
- Після вибору першого осередку, регулювати тільки Z-фокус з програмним забезпеченням. З цієї точки, не змінюють фокусування вручну на мікроскопі тіла за допомогою "Z-ручки", якщо це не цифровий кодуванням. Переконайтеся, що після кожної процедури автофокусом новий X, Y, Z позиції зберігаються програмним забезпеченням.
- Перевірте настройки автофокусу підходять для експериментів, перш ніж почати працювати. Використання фазово-контрастної мікроскопії може поліпшити автофокусом рутинних в порівнянні з використанням світлого або DIC мікроскопії, в зв'язку з посиленням контрасту. Проте, фазовий кільце в фазового контрасту мети робить їх менш чутливими (близько 10%) в зборі світла флуоресценції. Так для слабких люмінесцентні зразки, мета без фазового кільця більше підходять.
- Перевірте вибрані комірки як і раніше в центрі уваги щопівгодини, поки експеримент працює стабільно. Коли клітини в даний момент знаходяться поза фокусом, регулювати вручну. Через зміни температури, а також погано висушених зразків, це може бути необхідно протягом першої години. Крім того, через підвищену контрастності, автофокус працює краще, коли більше клітин в полі зору.
- Після експеримент закінчено, окремі різні канали кіно та безпечного їх у вигляді окремих файлів (наприклад, фазового контрасту, GFP, mCherry), якщо потрібно (деякі пакети придбання буде місце для всіх каналів в один стек файл). Для публікації, фотографії можуть бути підвищена за рахунок 2D деконволюции, що особливо насeful для дослідження білків локалізації. Deconvolve зображень за допомогою програмного забезпечення вашого мікроскопа або комерційних пакетів, таких як Гюйгенс ( www.svi.nl ).
- Аналіз даних за допомогою ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) (Використовуйте сирі, необроблені файли зображень для цього) і Microsoft Excel або Sigma ділянки. Стеки можуть бути, наприклад, зберегти як ". AVI" відеофайл в ImageJ. Детальний опис того, як флуоресценція одиночних клітинах може бути виміряний в часі, наводиться нижче.
4. Дані аналізу динаміки промоутер діяльності з використанням ImageJ
Відзначимо, що інші хороші пакети програм, які спеціалізуються на аналізі сповільненої зображень мікроскопії, таких як програмне забезпечення BHV 9, 4, Schnitzcell 10, PSICIC 11 і Мікроб-Tracker 12, але тут ми зосередимося на вільно доступний пакет ImageJ.
- Завантажити ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) І (при необхідності) правильний плагін для відкриття (стек) файлу. Наприклад, фільми записані за допомогою deltavision мікроскоп може бути відкритий тільки у ImageJ з плагіном ніж deltavision. Копіювання DV-плагін в папку плагінів ImageJ і запустити програму. Зміна обсягу пам'яті в файлі / опція / пам'яті і теми з 1250 року. Це дозволяє працювати з великими файлами, таких як отримані з покадровой фільмів.
- Для оцінки клітина історія однієї єдиної клітини, відкриті в оригінальному фільмі фазового контрасту однієї мікроколонія і виділіть останній кадр інтересу до кіно. Виберіть "сегментованим лінії" Кнопка вибору в меню.
- Намалюйте лінію в фоновому режимі і натисніть "Ctrl" + "T". Це відкриє регіонах, що представляють інтерес (ROI), менеджер. (Відповідне значення флуоресценції фону можна використовувати, щоб вручну відняти фон - .. Див. Нижче Замість цього можна використовувати звичайний віднімання фону присутній в ImageJ) Також намалювати лінію в клітці інтересів і додати до ROI менеджер ROI. Так як ми досліджуємо промотор-GFP злиттів в цьому випадку вивчення і GFP поширюється по всій цитоплазмі, всієї клітини повинні мати аналогічні флуоресценції значення для кожного окремого пікселя по всій довжині клітини. Виділіть один кадр назад в часі і вибрати новий ROI в тій же камері, що представляють інтерес. Зберегти цю третю ROI і продовжити процедуру, поки відповідні ROI в перший кадр фільму був збережений.
Майте на увазі, що флуоресценція дочірні клітини можуть сильно відрізнятися після поділу клітини. Або використовувати мембрани барвник, який може бути застосований разом з флуоресценції білків, вироблених клітинами (наприклад, поєднання червоного барвника мембрани FM ® 5-95 (Invitrogen) і GFP) для візуалізації перегородки освіти. У цьому випадку відповідна флуоресценції канал, а не фільм фазового контрасту слід використовувати слідувати клітини в часі. Крім того, можна залишатися на безпечній стороні, вибравши ROI в тільки одну половину клітини. - В менеджер ROI, натисніть кнопку "Зберегти". Якщо закінчення файлу ". Рої", то рої обраний в списку, і тільки для нього будуть збережені. Якщо закінчення файлу ". ZIP", то весь набір буде збережений (обов'язково).
- Закрити фільм фазового контрасту і відкрити вихідний флуоресценції кіно (наприклад, GFP). Натисніть кнопку "показати все" і "вимір" в менеджері ROI. Відкриється нове вікно (результати). Копіювання результатів в лист Excel і відняти середнє флуоресценції для кожної окремої клітини від фонової флуоресценції середовища. У результаті чистий флуоресценції може бути змова проти час розкрити промоутера активність клітини інтересів в часі.
- Крім того, флуоресценції всіх клітин мікроколонія можливість аналізу даних на певний момент часу точки. Для того, щоб зробити це вибрати і зберегти рентабельність по фон і кожну клітину в одному кадрі, як описано вище, копіювати флуоресценції значень Excel і виробляти гістограм використання "Гістограма" функції в "інструмент" меню.
- Для отримання зображення з окремих кадрів для публікації, виберіть кадр інтересу, виберіть "Зображення" - "копію зображення" і змінити тип зображення "RGB" або "8-біт", вибравши "образ" - "тип" - "RGB колір" або "8-біт". Зберегти кадр дублюється як ". Розмальовки". RGB / 8-bit фотографії можна відкрити за допомогою звичайних програм малювання, такі як CorelDraw або Adobe Illustrator. При необхідності, знімки можуть бути адаптовані за допомогою "образ" - "налаштувати" - "яскравість / контрастність" або "образ" - "налаштувати" - "вікно / рівень" в ImageJ.
5. Виробництво фільмів для публікації з ImageJ
- Відкрийте вихідний фазового контрасту і відповідний фільм флуоресценції (и) в ImageJ як описано вище. Виберіть прямокутна кнопка вибору (1-й зліва) і намалюйте прямокутник ROI в перший кадр таким чином, що розвиваються мікроколонія оточений ROI throughout весь фільм. Виберіть "Зображення" - "урожай" і безпечні це зменшена версія фільму під новим ім'ям. Виберіть той же ROI через менеджер ROI в флуоресценції фільм і перейти, як раніше.
- Щоб об'єднати фільми горизонтально або вертикально, виберіть "плагін" - "Стек комбайнера". При бажанні, часу штампа можуть бути додані за допомогою "плагінів" - "час штампа". Збережіть об'єднаний стек один раз ". DV" або ". Розмальовки" і один раз як ". AVI" або QuickTime фільмів.
Альтернативний протокол Пристосування для стрептококової пневмонії (рис. 4 і фільм 2):
6. Підготовка С. пневмонії культур
- Рости С. пневмонії клітин (капсульованих штам D39 13, або unencapsulated штам R6 14 вартим культур в C + Y середу 15 при 37 ° С до ОП при 600 нм приблизно 0,4 буде досягнута. Центрифуга клітини протягом 2 хв при 14000 оборотах в хвилину і ресуспендування осад клітин в обсязі свіжі C + Y середовищі, що містить 14,5% гліцерину (о / о), що призвело б до 600 нм точно 0,4. Аліготе клітини і зберігати їх при температурі -80 ° C для подальшого використання .
- Для покадрового мікроскопії, візьміть аліквоту раніше культурний С. пневмонії клітин. Прищепити 4 мл свіжої C + Y середній 1: 100 з осередками від -80 ° C аліквоту. Рости клітини до середини експоненційної фази ОП 600 нм до 0,1 - 0,2. Зазвичай це займає близько 2 годин при використанні клітини від -80 ° C аліквоти.
7. Підготовка мікроскопом зразка
- Підготовка скло мікроскопа, як описано вище для B. Сінна але переконайтеся, що агарозном містить комплекс С + Y середовища. З С. пневмонії є microaerophile, повітряні кишені між смугами агарози повинна бути менше, ніж для Б. Сінна (~ 1 мм простору з обох сторін).
- Виміряйте оптичну щільність культури при 600 нм (600), розвести експоненціально зростаючої С. пневмонії клітини приблизний 600 з 005 використанням C + Y середніх і використовувати це розведення, щоб завантажити слайд агарози.
8. Покадровий фазово-контрастної мікроскопії
Налаштуйте мікроскоп настройки для S. пневмонії: використовувати фазово-контрастної мікроскопії з С. пневмонії важко визначити використанням світлого поля мікроскопію. Продовжити протоколу, як це описано для В. Сінна (наступні кроки 2,9 - 3,7). С. пневмонії клітини можуть бути вирощені на будь-якому 30 ° C або 37 ° C (вони швидше ростуть при 37 ° С).
9. Представник результати:
Сповільненої флуоресценції експеримент БУВ проведень успешно, если бактерії превратились в мікроколонія моношару, Який Повністю розташованій в межах поля зору в кінці експеримент (див. Рис 5A-C). Якщо клітини росли один на одного, це не тільки неможливо простежити їх історію точно, але і флуоресценції рівнів перекриваються осередку не може бути виміряна правильно. Клітини мають тенденцію до зростання друг на друга, якщо плямистий клітини не були достатньо сухий (крок 2,9), або якщо склад середовища повинна бути скоригована, щоб отримати більш повільне зростання. Якщо мікроколонія виросла з точки зору, то розподіл флуоресценції сигналів в межах однієї колонії не може бути визначена. Причини "мікроколонія рух" може бути недостатньо сушки клітин плямистий (крок 2,9), або, якщо програмне забезпечення не було запрограмовано для відстеження мікроколонія в процесі розробки. Крім того, важливо, щоб місцеві плями збільшилися флуоресценції не виявляються в середовищі, так як це затемнює флуоресценції сигнали, що надходять від клітин (див. Малюнок 5D-F). Фон пов'язані проблеми можуть виникнути з з'єднань ЗМІ, повітряних бульбашок або нерозчинених згустки агарози. Щоб уявити собі це, ми наводимо на рис. 5F тлі сигналів цього певного слайда, коли зображення було отримано використанням збудження / випромінювання фільтри для червоних флуоресцентних барвників. Як видно, яскраві плями autofluorescent присутні яка могла б перешкодити зображень. Для запобігання таких місцях, переконайтеся, що агарозном повністю не розчиниться і Є немає повітряних бульбашок при розміщенні на покривне скло мікроскопа.
Малюнок 1: Експериментальний огляд
Малюнок 2: Підготовка мікроскопом зразка
Малюнок 3: Покадровий флуоресцентної мікроскопії Б. Сінна клітини приховування P kinB-GFP синтезу. Знімки взяті з фільмів 1. Топ панелей: світле поле, нижня панелі: GFP каналу.
Інжир Юр 4: Покадровий фазово-контрастної мікроскопії С. пневмонії штамом дикого типу R6. Знімки взяті з фільмів 2.
Малюнок 5: Ілюстрація можливих (сповільненій) результати мікроскопії. AC показує чинники, які повинні бути розглянуті на даних, отриманих з діаскопічній настройки світла. (А) Світле мікрофотографія моношару мікроколонія (позитивний результат) спороутворюючих Б. Сінна клітини (B) Світле образ Б. Сінна мікроколонія, в яких деякі клітини росли один на одного (негативний результат) (C) Світле образ спорулирующих B. Сінна мікроколонія, які виросли з області фокуса (негативний результат). DF-шоу факторів, які повинні бути розглянуті для даних, отриманих з епіскопічна настройки світла (D) фазового контрасту картини Б. Сінна клітин в експоненційної фазі зображені для візуалізації, де сигналів флуоресценції в Е і F виходять з (Е) сигналів GFP клітин показано в D. Зверніть увагу, що фон сигнали подібні в кожному пікселі (позитивний результат). Також відзначимо, що час експозиції може бути занадто багато, так як одна осередок показує насичених сигналу (негативний результат) (F) сигналів, отриманих через червоний коридор клітин показано в примітці, що Д. фон містяться ділянки з підвищеним рівнем червоної флуоресценції (негативний результат ).
Фільм 1. Покадровий флуоресцентної мікроскопії Б. Сінна клітини приховування P kinB-GFP синтезу. Знімки були зроблені в 8 хвилинні інтервали. Зліва: світле поле, праворуч: GFP каналу. Натисніть сюди, щоб подивитися фільм.
Фільм 2. Покадровий фазово-контрастної мікроскопії С. пневмонії штамом дикого типу R6. Знімки були зроблені в 10 хвилинні інтервали. Натисніть сюди, щоб подивитися фільм.
