1 Михайличенко В.Ю. 1 Столяров С.С. 1 Старих А.А. 1
1 Медична академія імені С.І. Георгіївського Федерального державного автономного освітнього закладу вищої освіти «Кримський федеральний університет імені В. І. Вернадського» Міністерства освіти і науки Російської Федерації
При аллоксановим діабеті спостерігаються зміни в організмі тварин, характерні для цукрового діабету 1 типу. Трансплантація культур клітин підшлункової залози кролика дозволяє ефективно коригувати рівень глікемії при цукровому діабеті у експериментальних тварин, а також призводить до ендокринної корекції порушень, викликаних аллоксановим діабетом. За рахунок підвищення концентрації інсуліну і С-пептиду зменшується рівень глікемії, знижується вміст контрінсулярнихгормонів, а також стабілізуються біохімічні показники крові (глюкоза, тригліцериди, ліпопротеїди). Під час гістологічного дослідження через 1 місяць після початку експерименту в підшлунковій залозі тварин при експериментальному ЦД відзначалося різке зниження числа острівців Лангерганса, а збережені острівці мали неправильну форму, невеликі розміри, складалися переважно з альфа-клітин. У підшлунковій залозі через 14 днів після трансплантації спостерігається гіпертрофія острівців Лангерганса, їх питома обсяг склав 0,3458 ± 0,025, що 2,67 рази менше, ніж в нормі, і в 5,77 рази більше, ніж у тварин без лікування. Однак розмір острівців був більше, ніж в нормі, на 1,88 рази (середнє число клітин в острівці склало 77,25 ± 1,42), що говорить про те, що вже до 14 дня після введення трансплантата новоутворені острівці досягають розмірів, порівнянних з розмірами нормальних острівців.
аллоксановим діабет
гормони
лікування
1. Гончарова О.В. Значення «шкіл цукрового діабету» в профілактиці цукрового діабету та його ускладнень у дітей і дорослих / О.В. Гончарова, Н.В. Зіміна, Р.І. Девішев // Російський медичний журнал. - 2012. - № 20. - С.1001-1007.
2. Дідів І.І. Сучасні можливості застосування стовбурових клітин при цукровому діабеті / І.І. Дідів, І.А. Лисуков, Д.Н. Лаптєв // Цукровий діабет. - 2014. - № 2. - С.20-28.
3. Закірьянов А.Р.Возможние шляху реалізації регенераційної стратегії при лікуванні цукрового діабету i типу методами клітинної трансплантації / А.Р. Закірьянов, Н.А. Онищенко // Гени і клітини. - 2007. - № 2. - С.23-33.
4. Трансплантація культури клітин підшлункової залози при аллоксановим діабеті (повідомлення 1) / О.І. Міміношвілі, В.Ю. Михайличенко, А.Г. Попандопуло та ін. // Вісник невідкладної і відновної медицини. - 2003. - Т.4. - № 3. - С.530-533.
5. З-kit-позитивні клітини острівців підшлункової залози щура як клітини-попередниці ендокріноцітов при аллоксановим діабеті / А.С. Плюшкіна, М.С. Калігін, Д.І. Андрєєва та ін .// Гени і клітини. - 2012. - № 3. - С.138-141.
Незважаючи на значний розвиток сучасної діабетології, проблема профілактики, ранньої діагностики, контролю за перебігом цукрового діабету (СД) у дітей і дорослих стала найгострішою медико-соціальною проблемою, яка в більшості країн світу позначена в числі пріоритетних напрямків розвитку охорони здоров'я. Приводячи до важких ускладнень і ранньої втрати працездатності, СД характеризується високою смертністю, в тому числі в молодому віці [1]. Клітинна терапія дозволяє в повному обсязі забезпечити доставку в організм необхідних пептидів і факторів міжклітинної взаємодії, які сприяють репаративної регенерації тканини підшлункової залози, приводячи таким чином до компенсації інсулінової недостатності [2,4]. Сучасні методи лікування СД не дозволяють домогтися нормального рівня глюкози в крові без епізодів гіпо- та гіперглікемії і повністю запобігти розвитку ускладнень ЦД. Заміщення β-клітин (пересадка підшлункової залози або β-клітин) супроводжується ускладненнями, вимагає довічної імуносупресивної терапії, при цьому далеко не завжди досягається інсулінонезалежний, а також є істотний дефіцит донорів. Одним з інноваційних методів лікування є застосування стовбурових клітин (СК), які позбавлені цих недоліків. Алогенних трансплантації СК ускладнені імунним відторгненням трансплантата, а використання ембріональних СК - етичними аспектами, складністю відбору клітинних ліній і ризиком виникнення тератом [3]. На сьогоднішній день одним з найбільш перспективних маркерів клітин-попередниць ендокріноцітов підшлункової залози є рецептор фактора стовбурових клітин C-kit або CD117, який бере участь в диференціюванні цих клітин в ендокріноціти в пренатальному розвитку і зберігається у дорослої людини в клітинах острівців підшлункової залози. Однак до сих пір залишається невивченим участь C-kit + -клітин-попередниць у відновленні популяції клітин острівців Лангерганса при цукровому діабеті I типу [5]. Новий погляд на проблему регенерацію тканини ПЖ, яка до недавнього часу вважалася органом, який абсолютно не відновлює ендокринну частину, і шляхи стимуляції репаративної регенерації відкривають нові можливі шляхи лікування і профілактики розвитку ЦД.
Мета - дослідити патофізіологічні зміни в організмі щурів при аллоксановим діабеті та ефективність їх корекції трансплантацією культури клітин підшлункової залози.
Матеріал і методи. Експериментальне дослідження виконано на 60 щурах самцях масою 200-250 г. Тварини були розділені на 3 групи по 20 щурів у кожній: 1 - контрольна група; 2 - тварини з аллоксановим діабет; 3 - тварини з аллоксановим діабетом, яким виконували трансплантацію культур клітин підшлункової залози кролика. Цукровий діабет викликали шляхом підшкірного введення розчину аллоксанатетрагідрата з розрахунку 20 мг на 100 г маси тіла, попередньо 2 доби голодуючим тваринам. Розчин аллоксана готували шляхом розведення кристалічного субстрату AlloxanTetrahydrate фірми Fluka-Sigma (Німеччина) у стерильній дистильованій воді. Після розчинення кристалів речовини, стерильність розчину здійснювали шляхом пропускання його через мембрану Millex-GV з фільтром 0,22 mm фірми MILLIPORE (Франція) і поміщали в стерильні закочені флакони.
Матеріалом для приготування культури клітин підшлункової залози служила підшлункова залоза (ПЖ) 3 місячного кролика породи Шиншила. У стерильних умовах експериментального операційного блоку під внутрім'язовим наркозом Ketamine + Xylazine в пропорції 40 + 7,5 мг / кг виконували верхнесредінную лапаротомию, мобілізували підшлункову залозу кролика, пунктіровать її головний проток, в який вводили 0,25% розчин трипсину. Після чого ПЖ негайно відкликали з організму тварини і поміщали в стерильний розчин середовища S 199 з антибіотиком і передавали для подальшої обробки в лабораторію клітинного і тканинного культивування ІНВХ АМН України. У лабораторії попередньо трипсінізірована підшлункову залозу механічно ділять на фрагменти розміром 1мм3 і піддають тепловій тріпсінізаціі при температурі 370С - 5 хвилин в 0,25% розчині трипсину (Інститут поліомієліту та вірусних енцефалітів, м.Москва). Дія трипсину зупиняють додаванням 5% сироватки великої рогатої худоби «Біолот» (м.Санкт-Петербург). Отриману ферментативно-дезагреговані клітинну суспензію центрифугують при 800 об / хв, протягом 6 хвилин. Супернатант зливають, а в клітинний осад додають живильне середовище Голка (Інститут поліомієліту та вірусних енцефалітів, м.Москва). Життєздатність клітин визначають в камері Горяєва, попередньо фарбуючи трипановим синім. Концентрація клітин в 1 мл суспензії становить при цьому 2,5 млн / мл. Трансплантацію культури ендокринних клітин ПЖ виробляли щурам в передню черевну стінку, товстої голкою в верхній квадрат живота з розрахунку 12000-15000 клітин на 1 щура.
Вміст глюкози, холестерину і тригліцеридів визначали за допомогою програмованого фотометра EppendorfEpac 6140, використовуючи відповідні набори реактивів виробництва «Диякон ДС» (Росія), «Diasys» (Німеччина), «LaChema» (Чехія). Співвідношення фракцій ліпопротеїдів визначали електрофотометріческім методом із застосуванням системи для електрофорезу «Helena» (Франція), в якості носія використовувалися плівки з ацетату целюлози. Концентрацію глюкози визначали глюкозоксідазним методом. Зміст холестерину досліджували ферментативним методом з холестеролоксідазой і пероксидазою. Визначення концентрації тригліцеридів проводилося ферментативним методом з гліцерокіназой і гліцерин-3-фосфатоксідазой.
Визначення змісту інсуліну, кортикостерону, С-пептиду, тироксину і трийодтироніну проводили радиоиммунологическим методом з використанням стандартних комерційних наборів реактивів фірми "Immunotech" (Чехія). Рівень інсуліну і С-пептиду визначали через 4-6 годин після трансплантації клітин, а також через 1,7 добу, 1 і 3 місяць.
У досвід брали тварин з середньою тяжкістю цукрового діабету (умовно виділяли 3 ступеня тяжкості перебігу цукрового діабету: легка - концентрація глюкоза крові була в межах 10 ммоль / л, середня - 10-15 ммоль / л, важка - 15 і більше).
Гістологічне дослідження органів (ПЖ, серця, нирок, судин) проводили на 6, 10, 14 і 30 добу після трансплантації ендокріноцітов ПЖ. Органи фіксувалися в 10% нейтральному формаліні і потім заливалися парафіном. Гістологічні зрізи забарвлювалися гематоксиліном і еозином, за Вергоффу, альциановим синім при рН 1,0 і 2,6, виконували ШИК-реакцію.
Дослідження забарвлених препаратів і морфометричне дослідження проводили за допомогою дослідного мікроскопа OlympusAX70 (Японія) і з'єднаної з ним комп'ютерної системи з програмою аналізу зображення AnalySIS 3.1 (Німеччина).
Статистичну обробку отриманих даних виконували на комп'ютері PentiumIII за допомогою програм «MicrosoftExcel 10.0», «Statistica 6.0» (USA).
Результати досліджень. Після введення діабетогенний дози аллоксанатетрагідрата спостерігалося кілька фаз змін вмісту глюкози крові: перша фаза - гіперглікемічна, що досягає максимуму протягом перших 2-4 годин; друга - гіпоглікемічна, яка в основному виявлялася протягом 15-24 годин, і нарешті третя фаза - фаза стійкою гіперглікемії (понад 24 годин).
Перші ознаки діабету проявлялися у вигляді різкого збільшення добового споживання води (понад 120 мл), поліфагія, поліурією, гіперглікемією, різкою втрати у вазі, випаданні волосяного покриву. У різні терміни експерименту розвивалися трофічні виразки гомілки, гангрена з самоампутацію хвоста. Близько 15% тварин загинуло в результаті гипергликемической або гіпоглікемічної коми в різні терміни розвитку аллоксановим діабету.
Відомо, що інсулінова недостатність при аллоксановим діабеті призводить до посиленого розпаду тканинних білків, підвищеному надходженню в кров амінокислот, збільшення загального азоту крові. Характерним порушенням ліпідного обміну є підвищення вмісту в сироватці ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ) до 41,7% (в нормі до 19,9%), тригліцеридів до 1,03 ммоль / л (в нормі до 0,47 ммоль / л), при р <0,05, а також зниження вмісту ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ) з 38,1% (норма) до 12,8%. Зниження рівня глюкози відзначали через 4-6 годин після трансплантації, яке супроводжувалося підвищенням рівня інсуліну крові до 12,3 мкМЕ \ мл і рівня С-пептиду до 0,5 нг \ мл. Надалі, через 1 добу рівень інсуліну підвищувався до 12,7 мкМЕ \ мл, а С-пептид - до 1,48 нг \ мл. Одночасно спостерігалося зниження рівня кортикостерону з 609 до 456 нмоль \ л, підвищення вмісту загального трийодтироніну з 1,08 до 2,15 нмоль \ л, загального тироксину з 20,1 до 36,4 нмоль \ л. У біохімічних аналізах відзначалося зниження рівня глюкози до 4,12 ммоль \ л. Також знижувалася концентрація тригліцеридів до 0,48 ммоль \ л і підвищувався вміст ЛПВЩ до 34,3%, хоча рівень ЛПНЩ залишався практично незмінним.
Відзначався достовірний ендокрінокоррігірующій ефект після трансплантації культур клітин ПЖ (табл.1), який проявлявся в нормалізації концентрації в крові інсуліну, С-пептиду, кортикостерону, тироксину і трийодтироніну.
Під час гістологічного дослідження через 1 місяць після початку експерименту в підшлунковій залозі тварин при експериментальному ЦД відзначалося різке зниження числа острівців Лангерганса, а збережені острівці мали неправильну форму, невеликі розміри, складалися переважно з альфа-клітин. У серці визначається виражена гіпертрофія міокарда, вогнищеві дистрофічні зміни кардіоміоцитів, стінка судин потовщена, разволокнени, просвіт їх розширений, навколо судин відзначаються осередки плазморрагіі. У нирках визначаються тонкі ніжні прошарки сполучної тканини між петлями звивистих канальців, в яких спостерігаються дистрофічні зміни. В судинах спостерігаються такі ж зміни, як і в судинах серця.
Таблиця 1
Динаміка біохімічних показників крові щурів в різні терміни досвіду (М ± m)
показники
норма
1 місяць аллоксановим діабету
1-е добу після трансплантації
7-у добу після трансплантації
1 місяць після трансплантації
3 місяці після трансплантації
Глюкоза ммоль \ л
4,31 ± 0,13
13,79 ± 0,25
4,12 ± 0,26
3,89 ± 0,18
3,92 ± 0,11
4,19 ± 0,1
Інсулін мкМЕ \ л
3,53 ± 0,21
1,9 ± 0,1
12,7 ± 0,7
3,7 ± 0,07
3,45 ± 0,08
3,01 ± 0,03
C-пептид
нг \ мл
0,73 ± 0,02
0,15 ± 0,01
1,48 ± 0,03
1,59 ± 0,08
0,83 ± 0,12
1,06 ± 0,03
Кортико-стерону
нмоль \ л
354 ± 24
609 ± 21
456 ± 6
414 ± 15
321 ± 9
357 ± 18
тироксин
нмоль \ л
39,5 ± 1,9
20,1 ± 0,8
36,4 ± 0,6
63 ± 1,5
56 ± 0,7
51 ± 1
Трійод-тіроніннмоль \ л
2,42 ± 0,15
1,08 ± 0,09
2,15 ± 0,06
2,44 ± 0,14
2,64 ± 0,06
1,88 ± 0,03
Таблиця 2
Середня кількість клітин в острівцях Лангерганса і їх питома обсяг
Тварини без лікування
Пересадка культури клітин ПЖЖ
Тварини без лікування
Пересадка культури клітин ПЖЖ
6-й день
5,68 ± 0,14
20,18 ± 3,78 *
0,0634 ± 0,0051
0,1287 ± 0,0078 *
10-й день
5,74 ± 0,12
41,21 ± 2,44 *
0,0652 ± 0,0061
0,1835 ± 0,0102 *
14-й день
5,54 ± 0,21
77,25 ± 1,42 *
0,0599 ± 0,0034
0,3458 ± 0,0122 *
30-й день
5,55 ± 0,15
85,25 ± 1,12 *
0,0541 ± 0,0075
0,3745 ± 0,0145 *
3 місяці
5,12 ± 0,22
84,14 ± 1,19 *
0,0557 ± 0,0054
0,3798 ± 0,0123 *
6 місяців
5,01 ± 0,24
84,79 ± 1,04 *
0,0412 ± 0,0102
0,3576 ± 0,0178 *
12 місяців
- **
83,97 ± 1,45
- **
0,3443 ± 0,0158
Примітки: середня кількість клітин в острівцях в контрольній групі склало 41,01 ± 0,24, перед лікуванням у діабетичних тварин -5,67 ± 0,13;
* - різниця між досліджуваним і попереднім показником достовірна (р <0,05);
** - жодна тварина без лікування не прожив більше 9 місяців.
Через тиждень після трансплантації культури клітин ПЖ в підшлунковій залозі експериментальних тварин спостерігали регенерацію острівців Лангерганса біля проток підшлункової залози (табл. 2). У складі островковой тканини визначалися всі типи клітин. За даними літератури джерелом регенерації ендокринних клітин є клітини стінки дрібних протоків підшлункової залози, які починають пролиферировать під впливом чинників зростання, що виділяються клітинами пересадженою культури, і диференціюватися в ендокринні клітини. Кількість новостворених острівців було менше в порівнянні з нормою. У підшлунковій залозі через 14 днів після трансплантації спостерігається гіпертрофія острівців Лангерганса, їх питома обсяг склав 0,3458 ± 0,025, що в 2,67 рази менше, ніж в нормі, і в 5,77 рази більше, ніж у тварин без лікування. Однак розмір острівців був більше, ніж в нормі, на 1,88 рази (середнє число клітин в острівці склало 77,25 ± 1,42), що говорить про те, що вже до 14 дня після введення трансплантата новоутворені острівці досягають розмірів, порівнянних з розмірами нормальних острівців.
висновок
При аллоксановим діабеті спостерігаються зміни в організмі тварин, характерні для цукрового діабету 1 типу. Трансплантація культур ендокріноцітов підшлункової залози кролика дозволяє ефективно коригувати рівень глікемії при цукровому діабеті у експериментальних тварин, а також призводить до ендокринної корекції порушень, викликаних аллоксановим діабетом. За рахунок підвищення концентрації інсуліну і С-пептиду зменшується рівень глікемії, знижується вміст контрінсулярнихгормонів, а також стабілізуються біохімічні показники крові (глюкоза, тригліцериди, ліпопротеїди). При гістологічному дослідженні відзначалася проліферація і регенерація збережених острівців Лангерганса через 2 тижні після введення культури клітин підшлункової залози. Таким чином, продемонстровано вплив аллоксановим діабету на вуглеводний, білковий і жировий види обміну і можливість їх корекції стимуляцією регенерації власної ендокринної частини підшлункової залози шляхом трансплантації ксеногенної культури клітин.
рецензенти:
Кубишкін А.В., д.м.н., професор, зав. кафедрою загальної і клінічної патофізіології Медичної академії імені С.І. Георгіївського ФГАОУ ВО «Кримський федеральний університет імені В. І. Вернадського» Міністерства освіти і науки Російської Федерації, м.Сімферополь;
Ільченко Ф.Н., д.м.н., професор, завідувач кафедри хірургії № 2 Медичної академії імені С.І. Георгіївського ФГАОУ ВО «Кримський федеральний університет імені В.І. Вернадського »Міністерства освіти і науки Російської Федерації, м. Сімферополь
бібліографічна посилання
Михайличенко В.Ю., Столяров С.С., Старих А.А. ПАТОФІЗІОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ РОЗВИТКУ аллоксановим цукрового діабету У ЩУРІВ В ЕКСПЕРИМЕНТІ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2015. - № 5 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=21551 (дата звернення: 23.06.2019).
Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Ru/ru/article/view?
