Епітеліальні клітини були виділені з тканин кишечника R. microplus відповідно до схеми, представленої на малюнку 1. Репрезентативні знімки флуоресцентної мікроскопії епітеліальних клітин кишечника, отримані з використанням цього протоколу, показані на Фіг.2 І 2В. Оскільки ізоляція клітин проводиться на полупоглощенном R. microplus, клітини з'являються як сингулярна, сферична, гладка морфологія поверхні і постійний розмір всієї вибірки. Відмінності в розмірах і типі популяцій клітин кишки стають більш очевидними після того, як тик продовжує ставати повністю насиченим дорослим.
Флуоресцентне забарвлення ядра ізольованих епітеліальних клітин за допомогою DAPI допомагає візуалізувати клітини. Погана ізоляція візуалізується так, щоб містити неповну дисоціацію епітаКлеток Еліца з різними популяціями клітин, ідентифікованих за допомогою різних розмірів і морфології клітин (рис. 2C і 2D)
Використовуючи цей протокол, приблизно 1,1 × 10 7 кліток в розрахунку на 1 мл з 50 клітинних кишкових розщеплення з життєздатністю 75-80% були успішно ізольовані від кишечника R. microplus. Перехресне забруднення від білків господаря (рис. 3А) можна звести до мінімуму шляхом адекватного ополіскування кліщів кишки до тих пір, поки вони не стануть білими, що призведе до білого / прозорого градієнту Перколла (Фіг. 3В).
Поверхневі білки виділяли шляхом біотінілірованія поверхневих білків, руйнування клітинних мембран і очищення біотінілірованние поверхневих білків магнітними стрептавідіновимі кульками. В цілому 20-24 мкг очищеної біотіниБелковие поверхневі білки можуть бути виділені для додатків з низхідним потоком від початкового розкриття кліщів розміром 50x, що використовують цей протокол. Порівняння білків за допомогою SDS-PAGE (фіг. 4A), срібне пляма (фіг. 4B), Dot-блот (фіг. 5) і ELISA (фіг. 6) показують, що описана методика успішно очищає біотінілірованние поверхневі білки від епітеліальних клітин, виділених з R. microplus tick потрошити.
Малюнок 1: Схематичне представлення для виділення біотінілірованние білків, присутніх на поверхні клітин мікросфери R. microplus. Будь ласка, cl Ick тут, щоб переглянути велику версію цього малюнка.
Малюнок 2: Візуалізація флуоресцентного мікроскопа (100x) епітеліальних клітин міокарда R. microplus, забарвлених DAPI. Програмне забезпечення використовувалося для проведення флуоресцентного накладення. A & B). Зображують епітеліальні клітини, успішно виділені з середньої кишки R. microplus. C / D) Епітеліальні клітини, виділені з кишечника R. microplus, заражені більшими тканинами тика.
Малюнок 3: градієнт Percoll, що містить DMEM: 20% Percoll: 40% Percoll. Рівні епітеліальних клітин були утворені між DMEM: 20% PErcoll і 20: 40% Percoll. (A) Розсіювати кишечник без належної промивання. (B) Поділ кишечника з достатнім ступенем очищення. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Малюнок 4: Електрофоретичне поділ біотінілірованние поверхневих білків виконується на 4-20% гель Tris-MOPS при 140 В протягом 55 хв при використанні 10 мкг зразка. (L), PageRuler попередньо пофарбовані білкові сходи (1) немічених Р. MicroPlus весь зразок кишки (2) біотінілірованние білки, витягнутий з Р. MicroPlus всієї кишки відповідно до кроку 6. (3) Білки з епітеліальних клітин, виділених з немічених R . MicroPlus кишки (4) біотінілірованние білки, екстраговані з R. microplus Епітеліальних клітин відповідно до кроку 6. (A) SDS-PAGE, забарвлене синім комассі (B) Срібне пляма.
Малюнок 5: Точковий аналіз. Стрептавідин-HRP кон'югований розведений 1/5000. (A) У загальній складності 10 мкг екстракту білкового білка кишки (B) біотінілірованние поверхневі білки, екстраговані з очищених епітеліальних клітин (10 мкг).
Малюнок 6: Оцінка життєздатності біотінілірованние поверхневих білків з використанням ELISA. ELISA поверхневих білків був розроблений кон'югованим антитілом Strep-HRP, розведеним 1/15 000, проти різних концентрацій біотінілірованние тікаK кишкових білків (від 0,7 нг до 100 нг). В якості негативного контролю над ELISA використовували немарковані білки кишкового білка і бичачий сироватковий альбумін (BSA). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
