Бак посів з цервикального каналу: розшифровка цитології мазка

1. Вплив способів мазка на результати аналізу
2. Забір цервікальногослизу для дослідження концентрації цитокінів
3. Розшифровка аналізу на цитологію шийки матки
4. Інтерпретація результатів дослідження бак посіву

Вивчення складу слизу дає можливість визначити роль цитокінів в діагностиці запальних процесів у пацієнток з ектопією шийки матки. Преаналітичний етап даного дослідження є вкрай важливим, так як саме від способу забору біологічного матеріалу залежить його остаточний результат

Вивчення складу слизу дає можливість визначити роль цитокінів в діагностиці запальних процесів у пацієнток з ектопією шийки матки.

Преаналітичний етап даного дослідження є вкрай важливим, так як саме від способу забору біологічного матеріалу залежить його остаточний результат. Стандартизація преаналітичного етапу дозволяє здійснювати індивідуальне спостереження за активністю змін на епітелії шийки матки у жінок з ектопією

Вивчення складу вмісту цервікального каналу в останні роки дало можливість:

1. визначити роль цитокінів в розвитку механізму противоинфекционной резистентності генітального тракту і діагностики запальних процесів у пацієнток з ектопією шийки матки;
2. оцінити противоинфекционную і протипухлинну резистентність локального імунної відповіді жіночого генітального тракту.

Комплекс лабораторних досліджень , Що сприяє більшій ефективності лікування патологій шийки матки і вирішення питань стандартизації призначення імуномодулюючих препаратів, дозволяє оптимізувати вивчення параметрів місцевого імунної відповіді. Це, в свою чергу, дає можливість проводити лікування пацієнток з урахуванням індивідуальних особливостей їх захворювання.

Вплив способів мазка на результати аналізу

Відомо що хронічні запальні процеси , Надмірне розростання тканин і злоякісне переродження клітин епітелію шийки матки тісно пов'язані з недостатністю і дисбалансом місцевої імунної реакції. Слизова шийки матки постійно піддається впливу несприятливих зовнішніх факторів, найбільш агресивними з яких є умовно-патогенні і патогенні мікроорганізми.

Внаслідок посилення вироблення клітинами імунної системи людини прозапальних цитокінів, що проникають в осередок запалення (Т-хелпери, природні кілери, мононуклеарние фагоцити), постійно запускається місцева імунна реакція.

За рахунок лімфоїдної гистиоцитарной інфільтрації з домішкою гранулоцитів, нейтрофілів, плазмоцитів і наповнення судин кров'ю відбувається посилення вироблення слизового секрету шийки матки з отторгшіхся, що зазнали дистрофічній трансформації епітеліальними клітинами і продуктами розпаду запалених тканин.

Все це призводить до зміни виділення медіаторів запалення, що в результаті і стає причиною переродження клітин епітелію і розвитку онкологічної патології шийки матки.

Сьогодні опубліковано багато наукових робіт про вивчення складу цитокінів при захворюваннях шийки матки . Однак єдиного методу забору матеріалу і його подальшої аналітичної обробки досі не вироблено. У зв'язку з цим результати аналізу рівня цитокінів в секреті цервікального каналу мають істотні відмінності у різних авторів, незважаючи на використання комплексу реагентів для твердофазного ІФА з однаковим діапазоном величин визначаються показників.

Аналіз методик дослідження рівня цитокінів, використаних різними авторами, показав, що найбільше значення має спосіб, яким проводиться мазок з цервікального каналу. Найнижчі показники рівня цитокінів були у авторів, які виробляли паркан виділень цервікального каналу пінцетом або ложкою Фолькмана на глибині 2 см від екзоцервікса. Матеріал розлучався в фізіологічному розчині до пропорції 1: 1. Для проведення аналізу застосовували комплект реагентів фірми ТОВ «Цитокін» (м.Санкт-Петербург).

Найвищі показники представлені у авторів, які виробляли паркан цервікального секрету за допомогою універсального зонда. Матеріал поміщали в пробірку з 1 мл буферного розчину. Потім проводилася екстракція шляхом струшування на вортексі протягом 1 хвилини. Проученная суміш центрифугували при 900 g протягом 5 хвилин.

Супернатант відділяли, заморожували і зберігали при температурі 80ºС до проведення аналізу. Далі визначали в слизу цервікального каналу зміст прозапальних і протизапальних цитокінів методом імуноферментного аналізу (ІФА). Для проведення аналізу також використовували комплект реагентів фірми ТОВ «Цитокін» (м.Санкт-Петербург).

Автори, які отримали середні значення, застосовували для забору цервікальногослизу урогенітальний зонд. Отриманий матеріал поміщали в пробірку з фізіологічним розчином в концентрації 0,155 М, в результаті чого можна було отримати розведення слизу 1: 200. Отримані зразки тестувалися за допомогою методу ІФА Визначення кількості цитокінів в зразках здійснювалося із застосуванням комплекту реагентів фірми «Вектор-Бест».

Таким чином, Преаналітичний етап дослідження рівня цитокінів в шеечном секреті грає величезну роль в інтерпретації отриманих результатів (діапазон визначених рівнів показників в біологічних рідинах: ІЛ-8 - від 0 до 250 пг / мл, ІЛ-6 - від 0 до 300 пг / мл ІЛ-1β - від 0 до 250 пг / мл).

Забір цервікальногослизу для дослідження концентрації цитокінів

Підготовка і проведення аналізу (набір реагентів ЗАТ «Вектор Бест»):

У дослідженні брали участь 49 пацієнток у віці від 20 до 40 років, в числі яких 21 жінка з вперше виявленою ектопією шийки матки, 18 жінок з рецидивом захворювання, а також 10 жінок без патологічних змін шийки матки (контрольна група).

Преаналітичний етап дослідження включав в себе наступні заходи:

• видалення зайвих виділень;
• обробка шийки матки і стінок піхви стерильним фізіологічним розчином;
• паркан цервікальногослизу за допомогою урогенітального зонда;
• розведення цервікальногослизу в 0,155 М розчині NaCl до отримання концентрації 1: 200;

Для того, щоб видалити зайві виділення, область, що підлягає дослідженню, обережно очищали стерильним ватним тампоном.

Для того, щоб зробити бак посів з цервикального каналу, застосовували м'який урогенітальний зонд, який вводили в цервікальний канал на глибину не менше 2 см і повертали двічі в одну і в іншу сторону. Встановлено, що для повного просочування зонда необхідно 0,05 ± 5 мг цервікальногослизу.

Просочений цервікальної слизом урогенітальний зонд переносили в пробірку типу Еппендорф від 1000 мкл розчину NaCl і струшували її за допомогою центрифуги-Вортекс СМ 70М-07 протягом 10 хвилин і отримували виділення цервікального каналу в концентрації 1: 200. Отримані зразки заморозили при -40 ºС і зберігали до моменту проведення аналізу.

Для обробки отриманих даних використовували стандартні статистичні методи і програмне забезпечення Microsoft Office Excel, а також пакет прикладних програм для науково-технічних обчислень Statistica v6.0, Microsoft Office Excel 2007. Застосовувалися методи непараметричної статистики.

Критерієм достовірності між двома незалежними групами виступив непараметрический критерій Манна-Уїтні, а також тест Вілкоксона. Дані представлені у вигляді медіани і інтерквартільного розмаху для непараметричних змінних.

Для оцінки діагностичних характеристик досліджуваного маркера використовувався аналіз кривої ROC (площа під кривою ROC не відрізняється від величини 0,5), який передбачає порівняння основних операційних характеристик тесту - специфічності і чутливості. Граничні значення біомаркери визначалися при побудові графіків залежності вищевказаних операційних характеристик від концентрації біомаркери в секреті цервікального каналу.

Результати проведеного аналізу наочно показують, що в шеечном секреті пацієнток як з вперше виявленою ектопією шийки матки, так і з рецидивом захворювання відзначаються високі рівні всієї групи прозапальних цитокінів.

Розшифровка аналізу на цитологію шийки матки

Рівень цитокінів у виділеннях цервікального каналу у обстежених жінок

Група обстежених

Медіана концентрації цитокінів, пг / мл (25-75 процентиль)

ІЛ-1β, нг / мл

ІЛ-6, нг / мл

ІЛ-8, нг / мл

ІЛ-10, нг / мл

контрольна група

8,3 * (2,6; 22,2)

15,6 * (4,7; 43,3)

102,9 * (21,7; 173,3)

7,1 (3,2; 9,9)

Жінки з рецидивуючим перебігом ектопії шийки матки

104,6 * (26,8; 378,4)

327,5 * (139,5; 484,9)

312,8 * (287,5; 329,4)

11,7 * (7,0; 22,0)

Жінки з вперше виявленою ектопією шийки матки

102,4 * (25,8; 418,8)

428,1 * (106,4; 953,1)

281,0 * (150,9; 325,2)

9,0 (2,4; 15,7)

* Р ≤ 0,05 у порівнянні з контрольною групою.

Інтерпретація результатів дослідження бак посіву

Цитологія мазка з цервікального каналу, розшифровка результатів якої дозволяє зробити однозначні висновки:

1. рівень прозапальних цитокінів ІЛ-1β у жінок з вперше діагностованою ектопією шийки матки і з рецидивом захворювання в 12 разів вище, ніж у пацієнток в контрольній груп ;.
2. вміст ІЛ-6 у пацієнток з первинним виявленням ектопії шийки матки в 27 разів вище, ніж у здорових жінок з контрольної групи, а у пацієнток з рецидивом захворювання даний показник вище в 20 разів (ІЛ-6 є регулятором процесу дозрівання антитіл, а також відповідає за продукцію лімфоцитів і імуноглобулінів, тому він бере участь в гострому запальному процесі у пацієнток з патологіями шийки матки);
3. концентрація ІЛ-8 в обох групах пацієнток з патологією шийки матки в 2,5-3 рази вище, ніж у здорових жінок, що говорить про активацію нейтрофілів строми шийки матки у відповідь на зовнішнє подразнення компонентами бактеріальної стінки (ІЛ-8 - потужний хемокін, що забезпечує переміщення Т-клітин, еозинофілів, моноцитів і нейтрофілів у вогнище запалення, і високе його зміст можна пояснити присутністю в піхву здорових жінок умовно-патогенної мікрофлори, яка взаємодіє з місцевим імунітетом).
4. Концентрація ІЛ-10 у пацієнток з ектопією шийки матки вище, ніж у здорових пацієнток, в середньому в 1,2-1,6 рази, що говорить про дію механізму «ухилення» інфекційних агентів від місцевого імунітету, представленого в першу чергу фагоцитами.

Дослідження ROC-кривих і обчислення порогових значень показали, що підйом змісту в цервікальному вмісті ІЛ-1β до 62,4 нг / мл, ІЛ-6 до 437,7 нг / мл, ІЛ-8 до 310,7 нг / мл підтверджує наявність в області шийки матки вогнища гострого запалення. Це означає, що зазначені біологічні маркери є індикатором наявності запалення.

У ІЛ-10 в цервікальногослизу значення площі під кривою ROC достовірно не відрізняються від 0,5 - це означає, що даний маркер не має суттєвої діагностичної значущості у жінок, які брали участь в дослідженні.

Високі концентрації прозапальних цитокінів у виділеннях цервікального каналу демонструють перспективність дослідження основних прозапальних цитокінів як показників локального вогнища запалення в тканинах шийки матки, включаючи епітеліальне вистилання. При цьому зміна величин трьох видів прозапальних цитокінів слизу в діапазоні значень:

• ІЛ-1β від 30,6 до 62,4 нг / мл;
• ІЛ-6 від 74,8 до 437,7 нг / мл;
• ІЛ-8 від 189,2 до 310,7 нг / мл н

наочно показують індивідуальний характер знайдених змін.

Запропонована в даній статті стандартизація преаналітичного етапу дослідження виділень цервікального каналу дає можливість здійснювати індивідуальне спостереження за активністю запальних змін на шийці матки з ектопією при поточному контролі жінок.

Дана методика також підходить для виявлення ознак хронізації запалення, а також може бути використана при визначенні мішені для індивідуальної терапії та оцінки її ефективності.