Структура комплексу гірази (синя і рожева), ДНК (помаранчева) і моксифлоксацину (зелений). Видно, що антибіотик вбудовується між парами підстав - це відбувається за рахунок стекінг-взаємодії.
Зображення: Tim Blower
Колективу вчених під керівництвом Джеймса Бергера з університету Джона Хопкінса (Балтімор, США) вдалося вперше отримати кристали ДНК-гірази мікобактерій (Mycobacterium tuberculosis) в комплексі з ДНК і різними фторхінолонами, а також встановити точну просторову структуру каталітичного центру ферменту. Отримання точної структури комплексу дозволить використовувати раціональний дизайн для створення протитуберкульозних фторхінолонів. Робота дослідників опублікована в журналі Proceedings of the National Academy of Sciences.
Важливі в медичному сенсі антибіотики фторхінолони впливають на бактерій за рахунок того, що зупиняють в клітинах синтез ДНК. Відбувається це шляхом пригнічення ДНК-гірази, - ферменту, який регулює топологію ДНК. Гіраза вміє на короткий час розрізати ДНК і пропускати один її фрагмент через інший. Це дозволяє розплутуючи вузли, що неминуче виникають при копіюванні ланцюгів ДНК. Зв'язування фторхінолонів з гірази призводить до того, що фермент не може зшити розрізані ланцюга назад, синтез ДНК зупиняється і бактерія зазвичай гине.
Будова ДНК-гірази у різних бактерій дуже схоже, проте гіраза мікобактерій (бактерій, що викликають туберкульоз, вони ж «палички Коха») значно більш стійка до дії фторхінолонів, ніж, наприклад, кишкова паличка.
Щоб визначити причини цієї стійкості, вчені спробували встановити точну просторову структуру комплексів мікобактеріальній ферменту з ДНК і фторхінолонами.
Для вирішення таких завдань традиційно застосовується рентгеноструктурний аналіз: вчені досліджують характер дифракції рентгенівських променів кристалом білка, в якому всі атоми жорстко впорядковані. Отримання таких кристалів для великого і рухомого мультісуб'едінічного ферменту, такого як гіраза, - завдання нетривіальне. Щоб зробити гиразу більш «жорсткою» та відповідною для кристалізації, автори нової статті частково вкоротили і зшили разом білкові ланцюги, з яких вона складається (зрозуміло, було перевірено, що така модифікація не приводить до втрати зв'язування антибіотиків).
Отримана структура виявила особливості фторхінолон-зв'язуючого кишені гірази мікобактерій. Як і передбачалося, молекула антибіотика вбудовується між основами ДНК, яку розрізає фермент (така взаємодія це називається «стекінг»). Крім того, вона пов'язана з ферментом через «місток» водневих зв'язків між молекулами води і іоном магнію, які беруть участь в каталізі. Одна з амінокислот, що підтримують ці зв'язки в гірази інших бактерій - серин - у мікобактерій замінена на аланін, який в таких взаємодіях не бере; таким чином, молекула антибіотика виявляється пов'язана з ферментом в цілому менш стабільно.
Вчені також отримали ряд структур з декількома схожими фторхинолонами, які відрізнялися один від одного тільки бічними групами, але при цьому демонстрували великий розкид по здатності пригнічувати гиразу. Виявилося, що водневий «місток» у всіх цих випадках формується однаково, тому за міцність зв'язування, мабуть, відповідають і інші механізми: можливо, це нюанси розподілу зарядів всередині молекули, що впливають на силу стекінг-взаємодії. Так, видалення одного атома кисню з маленькою бічний групи антибіотика призводить до майже 10-кратне збільшення активності, причому таке похідне зберігає здатність пригнічувати гиразу навіть при мутаціях, ще більше послаблюють водневий «місток».
На жаль, на даний момент учені не вміють передбачати стекінг-взаємодії досить точно, щоб спроектувати «ідеальний» препарат без застосування методу проб і помилок. Занадто різке посилення взаємодії з ДНК може привести до того, що препарат стане токсичним для клітин людини - він почне пригнічувати аналог бактеріальної гірази в людських клітинах - топоїзомеразу. Проте, дослідники можуть міняти інші потенційно здатні контактувати з ферментом частини молекули фторхинолона. Теоретично, такі контакти можуть посилити зв'язування з гіразу, але ще важливіше те, що багатоцентрове зв'язування дозволило б боротися з мутаціями, що забезпечують стійкість до антибіотиків: мутації відразу в двох місцях вкрай малоймовірні.
Туберкульоз щорічно забирає життя до півтора мільйонів чоловік. Хоча в даний час це виліковне захворювання, курс лікування з 3-4 антибіотиків займає як мінімум півроку (до 2 років у разі лікарсько-стійкої форми). Подальше поширення стійкості викликає великі побоювання у лікарів (докладніше про цю проблему ми вже писали ). Застосування антибіотиків ускладнюється труднощами постановки діагнозу: часто туберкульоз помилково діагностують як пневмонію і неправильне лікування викликає появу стійких до ліків бактерій в організмі пацієнта.
Фторхінолони недавно увійшли в практику лікування туберкульозу і є порівняно нетоксичними і перспективними для подальшої розробки препаратами. З іншого боку, проблеми представляють не тільки знижена чутливість гірази мікобактерій до фторхінолонів, а й наявність в їх геномі спеціального білка, додатково захищає ДНК-гіразу. Традиційним підходом до викорінення захворювання в розвинених країнах є вакцинація; проте, в Індії та Африці, де туберкульоз ендемічний, програма вакцинації зіткнулася з великими труднощами і до сих пір не привела до успіху. Навіть при наявності величезної політичної волі у зацікавлених держав, за оцінками ВООЗ може змінитися не менше двох поколінь, перш ніж захворювання буде поставлено під контроль.
Дмитро Гіляров
