Винахід відноситься до медичної і ветеринарної бактеріології і може бути використано для диференціації антибіотиків по бактерицидній бактеріостатичного дії. Спосіб включає наступні операції: готують послідовні розведення досліджуваного антибіотика в живильному середовищі з індикатором в лунках планшети, потім додають в лунки з антибіотиком (досвід) і лунки з живильним середовищем (контроль) досліджуваний матеріал, що містить бактерії. Планшету інкубують протягом 3-6 ч і реєструють наявність росту бактерій по помутніння і / або зміни забарвлення середовища. При наявності росту в контролі і відсутності росту в досвідчених лунках з малим розведенням антибіотика в останніх знижують концентрацію антибіотика і продовжують инкубирование до 11-24 год. Потім повторно реєструють наявність росту бактерій за тими ж показниками і при його наявності визначають бактеріостатичнудію, а при його відсутності - бактерицидну дію антибіотика. Зниження концентрації антибіотика здійснюють за допомогою бета-лактамази в разі диференціації бета-лактамних антибіотиків або методом серійних розведень для інших класів антибіотиків. 2 з.п. ф-ли, 3 табл.
Винахід відноситься до медичної і ветеринарної мікробіології і стосується способу визначення бактерицидного і бактеріостатичної дії антибіотиків.
Одним з найважливіших ознак для антибіотиків є тип їх дії на мікроорганізми - бактеріостатичний і бактерицидний (Навашин С.М., Фоміна І.П. Раціональна антибіотикотерапія. М., "Медицина", 1982, С.15-17). Такий поділ антибіотиків значною мірою визначає тактику їх застосування для лікування хворих (доза, спосіб введення, тривалість лікування, поєднана антибіотикотерапія і інші показники). Певний вплив на тип дії антибіотиків надають мікроорганізм, властивості антибіотика, а також їх концентрація. Для відмінності типів дії антибіотиків до теперішнього часу використовують встановлення життєздатності клітин найчастіше посівами в рідкі або агарові поживні середовища з визначенням числа бактерій до і після контакту з антибіотиком (Сазикін Ю. О. Біохімічні основи дії антибіотиків на мікробну клітину. М., "Наука ", 1965, с.11-13). У спеціальних цілях застосовують і інші методики, наприклад здатність бактерій до синтезу білка, диханню клітин, ферментації вуглеводів і інші показники їх життєдіяльності, а також реєструється приладами порушення морфології клітини (Сидоренко С.В., Федорович В.Ю. Прискорений метод визначення мінімальної переважної концентрації антибіотиків на планшетних спектрофотометрах з вбудованим термостатом. Тези 11-ї Російської науково-практичної конференції, 7-9.12.99 р "Внутрішньолікарняні інфекції - проблеми епідеміології, клініки, диагно тики, лікування та профілактики ". М., 1999, с.220-221). Однак найбільш доступним і доказовим бактерицидну типом дії є відсутність здатності клітин до зростання і розмноження після видалення антибіотика. Відомо, що існують бактеріальні ферменти, що виробляються мікроорганізмами сімейства Еnterobacteriасеае, які інактивують беталактамние антибіотики різних класів, в тому числі цефалоспорини I-IV поколінь, крім цефаломіцінов. Ці ферменти отримали назву беталактамаз розширеного спектру дії. За субстратної специфічності виділяють пеніциліназу - фермент, що руйнує пеніциліни ( "Антибактеріальна терапія" під ред. Страчунскій Л.С. та ін. М., 2000., с.ХШ). Фермент інактивує чутливі до нього антибіотики. Найбільш близьким за технічним рішенням і досягається позитивного ефекту до пропонованого способу визначення бактеріостатичної і бактерицидної дії антибіотиків є метод серійних розведень суспензії суміші бактерій і розчину антибіотика (Навашин С.М., Фоміна І.П. Раціональна антибіотикотерапія. М., "Медицина", 1982, с.72). Однак цей метод виконують в пробірках і в обсязі до 500 мкл. Результати враховують через 16-18 год інкубації посівів при 37oС по зміні кольору і помутніння середовища. При цьому визначають затримку росту бактерій без диференціації бактерицидного і бактеріостатичної дії антибіотика. Прототипом є спосіб визначення чутливості бактерій до антибіотиків із застосуванням індикатора фенолрот в середовищах Хенкса з сироваткою і гидролизатом лактальбумина, що входять до складу синтетичної середовища 199 для культури тканин, що дозволяє враховувати результати через 5-6 год по зміні кольору середовища після посіву стафілококів, кишкової палички , синьогнійної палички, протея, стрептокока і інших (більш 12 видів) бактерій родини Еnterobacteriасеае, що не завжди до цього часу супроводжується помутнінням живильного середовища (Леві М.І., Гор ожанкіна І. А., Сагатовського Л.А. Швидкий метод визначення чутливості культур до різних антибіотиків в рідкому середовищі. Антибіотики, 1, 1967, С.57-60). У зазначеному способі-прототипі не передбачена можливість диференціювати бактериостатический і бактерицидний тип дії антибіотиків. Метою винаходу є підвищення надійності методу і прискорення визначення з розмежуванням типу бактериостатического і бактерицидного дії антибіотиків. Поставлену мету досягають використанням очищених препаратів беталактамаз для інактивації чутливих до них беталактамного антибіотиків і подальшого безперешкодного зростання вижили бактерій в пробах. Це визначають по зміні забарвлення і (або) мутності середовища. Ферментують глюкозу бактерії окислюють її, що реєструє індикатор в рідкому середовищі, змінюючи колір. При цьому деякі бактерії можуть подщелачивать її. Чи не ферментують глюкозу бактерії не змінюють рН, але зростання супроводжується помутнінням середовища. Пропонований спосіб виконують в три етапи. Дослідження проводять в стерильних 96-ямковий планшетах, призначених для імуноферментного аналізу одноразового застосування (ТУ 64-2-375-86. "Медполимер", Санкт-Петербург) або інших подібних планшетах. Перший етап - послідовне дворазове (або з іншим інтервалом) розведення досліджуваного антибіотика в двох паралельних рядах в 8 або 12 лунках планшета в обсязі 50 мкл кольоровий живильного середовища з 0,5% глюкози і 0,002% бромкрезолового пурпурового як індикатор. Середовище за рН 7,4-7,7 має інтенсивний бузковий колір. Другий етап - додавання в усі лунки з антибіотиком по 50 мкл суспензії досліджуваних бактерій у зазначеній кольоровий середовищі, що містить 2 
107 мікробних клітин (м. К.) 1 мл по оптичному стандарту мутності. Після ручного струшування пластини поміщають в термостат при 37oС, де інкубують протягом часу, необхідного для появи зростання бактерій в контролі (без антибіотика). Для більшості бактерій родини Enterobacteriaceae потрібно для цього 3-6 ч. При відсутності зміни кольору в контролі пластини залишають в термостаті, продовжуючи спостереження. Після інкубації реєструють результати. Прискорення зростання бактерій досягається зменшенням обсягу живильного середовища, як це було встановлено раніше (Патент на винахід 2151187: Спосіб визначення ефективності парової стерилізації бактеріологічним методом. Ю.Г. Сучков, М. І. Леві. 20.06.2000 р), і необхідної концентрацією бактерій в ній (до 105 м.к.). Подальше підвищення концентрації не доцільно, так як результат може спотворюватися за рахунок появи спонтанних мутантів зі стійкістю до антибіотиків, які можуть з'являтися з частотою 1 10-6-1 10-13 (Навашин С.М., Фоміна І.П. Раціональна антибіотикотерапія. М., "Медицина", 1982, с.26). Третій етап дослідження. Після реєстрації зростання бактерій додають в один ряд 50 мкл розчину беталактамаз в кольоровий середовищі в надмірній дозі, в 3-6 разів перевищує мінімальну, для надійної нейтралізації найбільшої концентрації антибіотика, що з'ясовують емпірично до проведення дослідження або виходять з визначення 1 ОД беталактамаз. За 1 ОД приймається найменша кількість препарату ферменту, здатне інактивувати 60 ОД пеніциліну протягом 1 год при 37oС (Машковський М.Д. Лікарські засоби. М., 1978, ч. II, с. 35-36). В іншій паралельний ряд додають 50 мкл кольорового середовища. Пластини знову поміщають на 3-5 або до 18-24 год в термостат при температурі 37oС. Результати реєстрації зростання бактерій після другого етапу порівнюють із зростанням після додавання ферменту. При бактеріостатичну дію антибіотика на бактерії після додавання пеніцилінази з'являється ріст бактерій в тих лунках, де його не виявили після другого етапу дослідження. При бактерицидну дію антибіотика зростання бактерій не відновлюється. Способом розмежування бактериостатического і бактерицидного дії антибіотиків, що не входять в групу беталактамного, є використання розведення суміші антибіотика і бактерій до таких концентрацій, коли стає можливим розмноження бактерій і реєстрація цього розмноження. У цьому способі була використана здатність бактерій (в присутності підпорогових концентрацій антибіотика) розмножуватися, що документується зростанням колоній на агарі, помутнінням рідкої живильного середовища або зміною її кольору в результаті утилізації глюкози. Способи досліджені в порівнянні зі способом-протопип за критеріями зміни забарвлення і (або) помутніння середовища при плановому бактеріологічному дослідженні матеріалу від гнійно-септичних хворих в лікувально-профілактичних установах Москви. Застосування в дослідженні невеликих обсягів інгредієнтів поряд з прискоренням отримання результатів приносить економічний ефект. Використання запропонованого способу розмежування бактериостатического і бактерицидного ефекту дії антибіотиків грунтувалося на "Методичних рекомендаціях щодо прискореного відбору ефективних антибіотиків для лікування хворих госпітальними інфекціями", затвердженими МОЗ РФ 10.01.2000 р, 1100 / 26-0-117. Приклад 1. Визначення бактерицидної і бактеріостатичної дії натрієвої солі бензилпеніциліну на музейні культури бактерій. В експериментальних дослідженнях використовували музейні бактеріальні штами Е. соli К-12, Stahylococcus aureus Wood, Yersinia реstis ЕV (вакцина), Yersinia рsеudotuberculosis 1985 III серовара, Васillus аnthracis СТІ (вакцина), Васillus сеrеus 96, Васillus subtilis 168, Васillus stearothermophilus ВКМ- 718. Всі культури бактерій вирощували при температурі 37oС, крім Yersinia реstis ЕV (26 ° С) і Васillus stearothermophilus (55oС). В якості основи рідкої живильного середовища застосовували живильний бульйон для культивування мікроорганізмів, сухий, НВО "Живильні середовища" (м Махачкала), в який додавали 0,5% глюкози і 0,002% індикатора бромтимолового синього або бромкрезолового пурпурового (кольорова середа). Розчин натрієвої солі бензилпеніциліну 1000 мкг / мл титровали в двох паралельних рядах для кожної культури кольорового середовища дворазовим послідовним розведенням в обсязі 50 мкл. В обидва ряди додавали по 50 мкл суспензії бактерій в кольоровий середовищі з концентрації 2 107 м.к. в 1 мл. Пластини з посівами після ручного струшування поміщали в термостат при оптимальній для кожного мікроорганізму температурі. У контрольних лунках знаходилися бактерії без антибіотика. Після пожовтіння середовища в контрольних посівах реєстрували результати, а потім в один ряд додавали по 50 мкл розчину пеніцилінази з вихідної концентрацією 1000 БД в 1 мл кольорового середовища, в інший ряд додавали по 50 мкл тієї ж середовища без ферменту. Через 11-12 год додаткової інкубації при оптимальних для бактерій температурах знову реєстрували зростання бактерій і порівнювали з першим результатом (табл. 1). За цими даними видно, що облік зростання бактерій в випробуваних середовищах можливий через 3-5 ч. Додавання пеніцилінази з подальшим инкубированием посівів в ряді випадків призводить до появи росту бактерій в тих лунках, де раніше колір середовища не змінився. Однак для St. аureus, Y. рsеudotuberculosis і В. сеrеus - високочутливих до антибіотика, ця різниця не перевищувала дворазового значення. У той же час МЗК після додавання пеніцилінази для інших бактерій зростала більш ніж в 40-80 разів. У способі послідовного дворазового розведення антибіотика з використанням автоматичних піпеток зі знімними наконечниками різниця в одне розведення (в 2 рази) не є доказовою. Тому результати, отримані в поживних середовищах з двома випробуваними індикаторами, слід визнати ідентичними і вважати, що в даних умовах постановки досвіду пеніцилін має бактерицидну дію на St. аurеus, Y. рseudotuberculosis і В. сеrеus, а для інших видів за даних умов досвіду пеніцилін надає бактеріостатичний тип дії. Приклад 2. Визначення бактерицидної і бактеріостатичної дії натрієвої солі бензилпеніциліну на Staphylococcus аurеus. Змішували суспензію Staphylococcus аurеus, штам Wood з розчином пеніциліну і після експозиції при 37oС готували послідовні розведення суміші в кольоровий живильному середовищі, як зазначено в табл. 2. Після 24-годинного термостатирования при 37oС враховували результати. Затримка росту бактерій з пеніциліном відбувається до розведення суміші 1: 64 тис. При зростанні бактерій в розведеннях з 1: 128 тис. До 1: 1 млн., Як і в контролі, при відсутності зростання в наступних розведеннях, де і теоретично не було бактерій . Поява зростання в розведеннях 1: 128 тис. - 1: 1 млн. Відбулося за рахунок зниження вмісту антибіотика нижче мінімальної затримує концентрації. У паралельному ряду з доданою пеніциліназою у всіх ланках, в тому числі при максимальній концентрації антибіотика, спостерігали зростання бактерій (пожовтіння і помутніння середовища). Наявність бактерій в цих лунках підтвердили посівами з них на поживний агар. Приклад 3. Визначення бактерицидної і бактеріостатичної дії небеталактамного антибіотика - ципрофлоксацину. Наводяться результати досвіду з раневим виділенням хворого Т-ва. У лунках планшета антибіотик протитрований з 4-кратним інтервалом, після чого висушений. У всі лунки додано виділення 6-го Т-ва. Через 6 год виявили затримку росту бактерій в перших трьох лунках при концентрації антибіотика. З цих лунок зробили ряди послідовних дворазових розведень ( "вертикальне титрування") в кольоровий середовищі в обсязі 50 мкл. Посіви в планшеті інкубували при 37oС протягом 14 год. Результати наведені в табл.3. У контролі і низьких концентраціях антибіотика зростання бактерій виявили в тих же розведеннях, що і в рядах, де в початкових ланках планшета була затримка розмноження бактерій за рахунок високої концентрації ципрофлоксацину. При зниженні концентрації розведенням нижче 6,2 мкг / мл виявили зростання бактерій. Отже, як в прикладах 1 і 2 з пеніциліном, так і прикладі 3, але методом серійних розведень, довести не бактерицидну, а бактеріостатичнудію небеталактамного антибіотика - ципрофлоксацину.
формула винаходу
1. Спосіб визначення бактеріостатичної і бактерицидної дії антибіотика, що відрізняється тим, що готують послідовні розведення досліджуваного антибіотика в живильному середовищі з індикатором в лунках планшети, потім додають в лунки з антибіотиком (досвід) і лунки з живильним середовищем (контроль) досліджуваний матеріал, що містить бактерії , планшету інкубують протягом 3-6 ч, потім реєструють наявність росту бактерій по помутніння і / або зміни забарвлення середовища і при наявності зростання в контролі і відсутності росту в досвідчених лунках з малі розведенням антибіотика в останніх знижують концентрацію антибіотика і продовжують инкубирование до 11-24 год, після інкубування повторно реєструють наявність росту бактерій за тими ж показниками і при його наявності визначають бактеріостатичнудію, а при його відсутності - бактерицидну дію антибіотика. 2. Спосіб за п.1, що відрізняється тим, що концентрацію антибіотика знижують додаванням бета-лактамази. 3. Спосіб за п.1, що відрізняється тим, що концентрацію антибіотика знижують методом серійних розведень.
МАЛЮНКИ
Малюнок 1 , малюнок 2 , малюнок 3
