Резистентність Helicobacter pylori до антимікробних препаратів за результатами бактеріологічного тестування

1. Матеріал і методи дослідження
2. Статистичний аналіз
3. Результати дослідження
4. Обговорення
5. висновки та рекомендації

Ерадикація H. pylori у інфікованих пацієнтів, які страждають на хронічний гастрит, виразкову хворобу, функціональною диспепсією та іншими H. pylori- асоційованими захворюваннями, є основною стратегією запобігання розвитку некардіального раку шлунка [1]. У будь-якій клінічній ситуації, при якій лікар сумнівається в необхідності діагностувати інфекцію H. pylori і провести знищення мікроорганізму, додатковим і вкрай актуальним аргументом на користь цих заходів має стати профілактичний ефект ерадикації щодо виникнення раку шлунка, особливо у пацієнтів з обтяженим спадковим анамнезом [2] .

H. pylori має широкий спектр чутливості до антимікробних препаратів. «Дикі» штами H. pylori чутливі in vitro до бета-лактамних антибіотиків (за винятком цефсулодіна), макролідів, нітроімідазолу, нітрофуранам, тетрацикліну, фторхінолонів, фосфоміцину, феніколам, аміноглікозидів, хлорамфеніколу, рифампіцину і препаратів вісмуту [3]. Однак далеко не всі препарати використовуються в схемах ерадикації. Так, застосування хлорамфеніколу обмежено через токсичної дії (особливо на кістковий мозок), аміноглікозидів через особливості фармакокінетики (вони є катіонними гідрофільними сполуками, які погано проникають через мембрани шляхом пасивної дифузії і не всмоктуються з кишечника) [4]. У схеми ерадикації входить лише обмежений набір препаратів (кларитроміцин, амоксицилін, метронідазол, тетрациклін, левофлоксацин та препарати вісмуту) [5]. Резистентність H. pylori до антимікробних препаратів є визначальним фактором ефективності існуючих режимів ерадикації мікроорганізму [6]. При резистентності до кларитроміцину, що перевищує 15-20%, стартова антигелікобактерної терапії не забезпечує прийнятного рівня ерадикації 85-90% [6].

Метою даної роботи було отримання даних про стан первинної антибіотикорезистентності штамів H. pylori, виділених від пацієнтів в Санкт-Петербурзі.

Матеріал і методи дослідження

Дослідження по протоколу SHELF проводилося в Санкт-Петербурзі з травня 2013 по червень 2014 року. Схвалення було отримано в центральному та локальному науковому етичному комітеті відповідно до принципів Гельсінської декларації. У дослідженні використовувалися гастробіоптатов пацієнтів, які відповідають таким критеріям.

Критерії виключення:

1) пацієнти, раніше отримували антимікробну терапію для ерадикації H. pylori;
2) пацієнти, які отримували антибіотики з групи макролідів протягом одного року, що передував даного дослідження;
3) пацієнти, які беруть участь в будь-яких інших клінічних дослідженнях;
4) пацієнти, які отримували інгібітори протонного насоса і препарати вісмуту протягом двох тижнів, що передували цим дослідженням;
5) хворі, які приймають антибактеріальну терапію на момент забору матеріалу.

Критерії включення:

1) чоловіки і жінки у віці від 18 до 65 років;
2) пацієнти з інфекцією H. pylori, підтвердженої швидким уреазний тестом гастробіоптатов, отриманого при проведенні езофагогастродуоденоскопіі (ЕГДС);
3) рішення лікаря в рамках рутинної клінічної практики і діагнозу пацієнта провести ЕГДС з забором биоптата.

Під час ЕГДС у всіх хворих здійснювався забір гастробіоптатов для мікробіологічного дослідження. Біопсійний матеріал містився в пробірку типу «Еппендорф» зі стерильним 20% розчином глюкози і зберігався до відправки в лабораторію в умовах холодильника при +4 ° C. Протягом 2-4 годин гастробіоптатов доставлялися в лабораторію для посіву. Посіви здійснювалися відповідно до відпрацьованої методикою культивування [8].

В якості основи живильного середовища для виділення і культивування H. pylori використовувався колумбійський агар. Кожен зразок біопсії висівався паралельно на дві чашки Петрі з агаром, що містить антибіотики в наступних концентраціях: ванкоміцин в концентрації 6 мкг / мл, триметоприм, в концентрації 2 мкг / мл (розчиняли в спирті) і амфотерицин В (або налидиксовую кислоту) в концентрації 2 -10 мкг / мл.

Інкубація посівів здійснювалася в мікроаерофільних умовах при вмісті кисню близько 5%. Для цих цілей використовувалися анаеростатах системи GasPac100 c газогенеруючих пакетами типу GasPak (BBL CampyPak Plus Microaerophilic System envelopes with Palladium Catalyst).

На кров'яної живильному середовищі на 5-7 добу H. pylori формував дрібні, круглі, гладкі, прозорі, вологі колонії діаметром близько 1 мм. Колонії H. pylori, отримані в результаті первинного посіву матеріалу біопсії, використовували для приготування мазків, забарвлення їх по Граму і постановки уреазний тест.

Вирішення питання про приналежність виділеної культури до роду Helicobacter виносили на підставі характерної морфології виділених колоній, а також набору тестів: морфології культури в мазку, пофарбованому по Граму, і наявності характерних біохімічних властивостей (здатності до продукції уреази). Типові клітини H. pylori при мікроскопії мали вигляд тонких вигнутих ніжно-рожевих паличок.

Антибиотикорезистентности виділених штамів H. pylori вивчали, використовуючи метод серійних розведень, який заснований на реєстрації пригнічення росту мікроорганізму на живильному агарі, що містить певні концентрації антибіотика. Визначали чутливість штамів H. pylori до кларитроміцину, амоксициліну, левофлоксацину, метронидазолу і тетрацикліну. Робочі концентрації досліджуваних антибактеріальних препаратах в агарі були наступними:

• амоксицилін - 0,25; 0,12; 0,06 мкг / мл;
• кларитроміцин - 1,0; 0,5; 0,25; 0,12 мкг / мл;
• левофлоксацин - 2,0; 1,0; 0,5 мкг / мл;
• метронідазол - 16; 8; 4 мкг / мл;
• тетрациклін - 2,0; 1,0; 0,5 мкг / мл.

Середовища і розчини антибактеріальних препаратів готували безпосередньо перед використанням.

На чашки Петрі з ростом H. pylori додавали по 1-2 мл стерильного фізіологічного розчину і знімали бактеріальну масу. Інокулюм наносили бактеріологічною петлею на поверхню чашки Петрі з селективної кров'яної середовищем з певною концентрацією антибіотика, рівномірно розподіляючи по поверхні. Потім чашки Петрі поміщали в анаеростатах і інкубували при температурі 37 ° С протягом 3-5 діб. Після закінчення інкубації відзначали чашку з концентрацією антибактеріального препарату, що викликає повне пригнічення росту мікробів. Контроль чистоти зростання культури оцінювали по посіву на чашку Петрі з селективної кров'яної середовищем без додавання антибіотиків.

Даний метод дозволив поділити штами H. pylori на чутливі і стійкі [9]. Критерії розподілу штамів за ступенем чутливості наведені в табл. 1.

На кожного пацієнта, гастробіоптатов якого використовувався в дослідженні, заповнювалася індивідуальна реєстраційна карта (ІРК), яка дублювалася в базі даних Microsoft Access Database і містила демографічні, анамнестичні дані, результати проведених досліджень.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз виконувався за допомогою програмного пакета IBM® SPSS® Statistics, версія 21.0.

Демографічні та анамнестичні показники аналізувалися за допомогою методів описової статистики. Для дихотомічних показників резистентності були представлені 95% довірчі інтервали для частки резистентності до того чи іншого антибіотика. Подібний статистичний аналіз проводився щодо виявлення наявності H. pylori і виявлення резистентності до антибіотиків.

Результати дослідження

У дослідженні використовувалися гастробіоптатов 109 пацієнтів у віці від 18 до 64 років. Вік, стать і діагноз пацієнтів представлені в табл. 2.

У пацієнтів були діагностовані різні захворювання, асоційовані з H. pylori. Найбільш частою нозологій був хронічний гастрит - 78,9% (n = 86). Виразкова хвороба дванадцятипалої кишки (ДПК) діагностовано у 20,2% (n = 22), а виразкова хвороба шлунка - у 0,9% (n = 1).

Інфікування H. pylori було підтверджено у всіх пацієнтів уреазний тестом. Бактеріологічним методом мікроорганізм виділено лише у 56 пацієнтів, що склало 51,4% (95% ДІ: 42,0%, 60,8%). Такий відсоток відображає технічні труднощі, пов'язані з транспортуванням та культивуванням мікроаерофільна мікроорганізму.

Чутливість H. pylori до антимікробних препаратів вдалося визначити у 48 виділених штамів. Через мізерне зростання культури в 8 випадках оцінити антибіотикограму було неможливо.

Таким чином, в аналіз резистентності були включені 48 штамів бактерії, виділених від 48 пацієнтів. Серед аналізованих ізолятів H. pylori штамів, 17 (42,5%) були резистентні до метронідазолу, 13 (27,1%) - до левофлоксацину, 12 (25%) - до кларитроміцину. Крім того, було виявлено 3 (6,3%) штаму, стійких до амоксициліну. Всі тестовані штами були чутливі до тетрацикліну. У випадках виявлення резистентності до трьох і більше груп антимікробних препаратів, штам бактерії відносили до полірезистентних. В ході дослідження 5 (11,1%) мікроорганізмів були полірезистентними (табл. 3).

Подвійна резистентність до кларитроміцину і метронидазолу виявлена ​​у 2 (4,4%) ізолятів, метронидазолу і левофлоксацину - у 4 (8,3%) мікроорганізмів. Всі штами, резистентні до амоксициліну, були стійкі до кларитроміцину.

Частота резистентних штамів відрізнялася серед чоловіків і жінок, проте даний факт складно інтерпретувати через малої вибірки (табл. 4).

При аналізі частоти резистентності до кларитроміцину виявлені відмінності за нозологіями. Так, у 14 пацієнтів, які страждають на виразкову хворобу, було 5 (35,7%) випадків виділення штамів H. pylori, резистентних до кларитроміцину. У той же час у 34 хворих, у яких був діагностований тільки хронічний гастрит, частота виділення резистентних штамів до кларитроміцину була нижче - 7 (20,6%). Однак цей факт складно інтерпретувати через обмеженої кількості спостережень.

Обговорення

Згідно Маастрихтським рекомендаціям IV перегляду, рівень резистентності H. pylori до кларитроміцину в популяції є визначальним фактором при виборі схеми ерадикації [10]. Подібно до інших патогенів, хелікобактер має регіональні особливості резистентності. Резистентність безпосередньо корелює з частотою призначення антимікробних препаратів і затвердженими протоколами вибору антибіотиків [11]. Неможливо екстраполювати дані про резистентності, виявлені в одній країні, на іншу, в силу значних регіональних відмінностей чутливості мікроорганізмів. Так, резистентність до кларитроміцину в Нідерландах складає всього 5,6%, тоді як резистентність H. pylori до даного антибіотика в Австрії сягає 35,4% [11]. Рівень стійкості до метронідазолу в Пекіні склав 63,9%, а на Південно-Східному узбережжі Китаю - 95,4% [16, 17]. Для аналізу антибіотикорезистентності H. pylori в світі нами були відібрані найбільш масштабні дослідження, що проводяться з 2000 по 2013 рік. Проаналізовано 13 досліджень, з яких 3 європейських, 5 азіатських, 2 африканських і 3 американських. Більш докладно рівень резистентності до антибіотиків H. pylori в різних країнах наведено в табл. 5.

При аналізі результатів досліджень по антибіотикорезистентності H. pylori на території Росії звертає на себе увагу зростання рівня резистентності H. pylori до кларитроміцину. Так, в 1996 р в м Москві не було виявлено резистентних штамів до кларитроміцину. Уже в 1999 р рівень резистентності H. pylori до кларитроміцину склав 17,1%, в 2000 р 16,6%, в 2001 р 13,8%, а в 2005 р вже 19,3% [24, 25 ]. При інтерпретації показників резистентності важливо враховувати методику визначення чутливості. Так, при використанні тільки генотипического методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) можливі складнощі в інтерпретації результатів. Прикладом можуть служити дані, отримані в Санкт-Петербурзі - 39-40% резистентних штамів за даними ПЛР [26, 27]. У той же час резистентність до кларитроміцину при оцінці діскодіффузіонним методом, який теж має певні обмеження, склала всього 7,7% [28].

Найбільшу інформативність представляють дані про резистентності, отримані методом серійних розведень. На підставі тестування 133 штамів методом серійних розведень зроблено висновок про низьку резистентності в Смоленську в 2010 р [29]. У нашому дослідженні, при використанні подібної технології тестування, резистентність склала 25%, що ще раз ілюструє міжрегіональні відмінності чутливості мікроорганізмів.

Фенотипический метод визначення чутливості до антибіотиків рекомендований Інститутом з клінічних та лабораторних стандартів (CLSI), EUCAST, а також Маастрихтським угодою IV перегляду в якості основного методу визначення чутливості H. pylori до кларитроміцину [38]. Культуральний метод є високоспецифічний тестом, однак характеризується низькою чутливістю [39]. Визначення чутливості H. pylori до антибіотиків в нашій країні пов'язане з рядом труднощів. Успіх бактеріологічного виділення H. pylori багато в чому пов'язаний з правильністю відбору біопсійної зразків і дотриманням умов транспортування матеріалу в лабораторію. Хелікобактер є труднокультівіруемим мікроорганізмом, що вимагає не тільки навичок роботи з його чистою культурою, але і чіткого дотримання методики розведення робочих концентрацій досліджуваних антибактеріальних препаратів. З огляду на об'єктивні складності, описані вище, стає зрозумілим відсутність широко представлених даних про справжній стан антибіотикорезистентності в різних регіонах нашої країни. Більшість дослідників в своїх судженнях про антибіотикорезистентності H. pylori спираються на метод ПЛР як єдину доступну альтернативу бактеріологічному методу, який дозволяє визначити генетичні мутації H. pylori і прогнозувати фенотипічну резистентність [7].

Дане дослідження обмежена відносно невеликим числом спостережень - 48 чистих культур мікроорганізму. Безумовно, для розробки регіональних протоколів ведення пацієнтів потрібне подальше вивчення стану антибіотикорезистентності H. pylori. Однак в ході дослідження виявлено високий рівень первинної резистентності до кларитроміцину - 25%. При такому рівні резистентності ефективність стандартної потрійної терапії не перевищує 70% [40]. Крім того, левофлоксацин при виявленої 27,1% резистентності не може бути рекомендований в нашому регіоні як альтернатива кларитромицину. Широко застосовується ще кілька років тому «послідовна» терапія, позиціонована Маастрихтським угодою IV перегляду для регіонів з високою резистентністю до кларитроміцину в якості терапії першої лінії, в даний час втратила актуальність у зв'язку з накопиченим негативним досвідом [41]. Додатковим аргументом проти «послідовної» терапії служить виявлений нами високий (42,5%) рівень резистентності до метронідазолу, що істотно знижує ефективність даної схеми [6].

Аналіз літературних даних дозволяє констатувати кризові явища в пошуку ефективних схем ерадикації. Більшість стратегій спрямовані на збільшення кількості одночасно призначених препаратів. Яскравим прикладом може служити набирає популярність «гібридна» і «одночасна» схеми ерадикації H. pylori [42]. Відсутність реальних ефективних і безпечних альтернатив «класичної» потрійної терапії, отримані дані про резистентності H. pylori в Санкт-Петербурзі диктують необхідність використовувати всі можливості для підвищення ефективності стандартного підходу: подвійні дози інгібіторів протонного насоса, збільшення тривалості з 7 до 10-14 днів, додавання препаратів вісмуту і прибутків [2, 43].

Така стратегія була використана нами для лікування пацієнтів, гастробіоптатов яких використовувалися в даному дослідженні. Застосування стандартної потрійної терапії з подвійною дозою інгібіторів протонного насоса, посиленою препаратом вісмуту Трікалі діцітрата, призвело до знищення H. pylori у 93,2% пацієнтів, незважаючи на виявлену високу резистентність до кларитроміцину [44].

висновки та рекомендації

На підставі проведеного бактеріологічного дослідження антибіотикорезистентності штамів H. pylori можна зробити наступні висновки та рекомендації:

1. Виявлено високий рівень первинної резістентності до кларітроміціну в Санкт-Петербурге - 25%, что НЕ дозволяє рекомендуваті использование стандартної потрійної терапії.
2. Проведення дослідження обмежує возможности! Застосування левофлоксацину в якості альтернативи кларитромицину, оскількі резістентність до него перевіщує 27%.
3. Високий рівень резістентності до метронідазолу, что перевіщує 40% (42,5% в даного дослідженні), ставити під сумнів доцільність использование «послідовної» терапії в якості терапії Першої Лінії.
4. Бактеріологічний метод визначення чутливості H. pylori є «золотим стандартом» визначення чутливості H. pylori до кларитроміцину. Для підвищення чутливості методу потрібне чітке дотримання методики роботи з біоматеріалом.

Отримані дані про резистентності H. pylori в Санкт-Петербурзі роблять актуальним використання всіх можливостей для підвищення ефективності стандартного підходу: подвійні дози інгібіторів протонного насоса, збільшення тривалості з 7 до 10-14 днів, додавання препаратів вісмуту і прибутків, пошук нових стратегій ерадикації.

література

1. Wald NJ The treatment of Helicobacter pylori infection of the stomach in relation to the possible prevention of gastric cancer . In: IARC Helicobacter pylori Working Group. Helicobacter pylori Eradication as a Strategy for Preventing Gastric Cancer. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer (IARC Working Group Reports, № 8); 2014 року, p. 174-180. http://www.iarc.fr/en/publications/pdfs-online/wrk/wrk8/index.php .
2. Івашкін В. Т., Лапіна Т. Л., Шептулин А. А., Трухманов А. С. і співавт. Практичні кроки по профілактиці раку шлунка в Російській Федерації: алгоритм ведення пацієнтів з хронічним гелікобактерним гастритом (Матеріали і резолюція ради експертів 9 грудня 2013) // Ріс. журн. гастроент., гепатол., Колопроктол. 2014; 24 (2): 102-104.
3. Lambert T., Megraud F., Gerbaud G., Courvalin P. Susceptibility of Campylobacter pyloridis to 20 antimicrobial agents // Antimicrob. Agents Chemother. 1986. 30: 510-511.
4. McNulty CA, Dent J., Wise R. Susceptibility of clinical isolates of Campylobacter pyloridis to 11 antimicrobial agents // Antimicrob. Agents Chemother. 1985. 28: 837-838.
5. Дехнич Н. Н., Захарова Н. В., Кузьмін-Крутецкий М. І. та ін. Резолюція експертного наради «Тактика ведення пацієнта з інфекцією Helicobacter pylori. Від простого до складного »// Клин. микробиол. і антимікробну хім. 2014. Т. 16. № 3. С. 176-180.
6. Graham DY, Lee YC, Wu MS Rational Helicobacter pylori therapy: evidence-based medicine rather than medicine-based evidence // Clin Gastroenterol Hepatol. 2014; 12: 177-186.
7. Lee JW GenoType HelicoDR test in the determination of antimicrobial resistance of Helicobacter pylori in Korea // Scand J Gastroenterol. 2014 року, Jun 24: 1-10.
8. Жебрун А. Б., Сварваль А. В., Ферман Р. С., Гончарова Л. Б. Методи лабораторної діагностики інфекції, зумовленої Helicobacter pylori. СПб, 2014. 60 с.
9. EUCAST. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. 2013; Version 3.1. Available from: URL: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Consultation/EUCAST_clinical_breakpoints_for_Helicobacter_pylori.pdf .

За іншим списком літератури? звертайтеся до редакції.

В. І. Симаненко *, 1, доктор медичних наук, професор
Н. В. Захарова *, доктор медичних наук, професор
А. Б. Жебрун **, доктор медичних наук, професор, член-кореспондент РАН
А. В. Сварваль **, кандидат медичних наук
І. В. Савілова *
Р. С. Ферман **

* ГБОУ ВПО СЗГМУ ім. І. І. Мечникова, Санкт-Петербург
** НДІ ЕІМ ім. Пастера, Санкт-Петербург

1 Контактна інформація: [email protected]

Купити номер з цією статтей в pdf