Повна кишкова ішемія був створений в невеликих кишкової петлі, використовуючи оклюзії судин з швом або затискачі, як показано на малюнку 1. Випускаючи затискачі, може виконуватися керований періоду реперфузії, дозволяючи для додаткового вивчення наступних реперфузійного ушкоджень при бажанні. Всі тварини вижили під час процедури з мінімальними ускладнення до евтаназії. Найбільш поширеним ускладненням хірургічних був гіпотонія, який дозволений з добавками позитивних інотропним наприклад добутамина.
Якщо виконано правильно, ішемічного пошкодження почнеться на кінчику кишкових ворсинок і мігрують вниз в склепі збільшенням тривалості ішемії (рис. 2). Одна загальна помилка з хірургічної техніки може статися коли кровоносні судини не лигируют або затискається рівномірно. Результатом є геморагічний ішемії (рис. 3), в якому тонкостінних вен падає до артерії, дозволяючи для додаткової крові проникнути в тканини. Це грубо розглядається як темний фіолетовий серозних поверхні (рис. 3, зліва) у порівнянні з світліше поверхні під час повної ішемії (рис. 3, право).
Після видалення ішемічного кишкової петлі кишкові крипти були успішно ізольовані після дисоціації протокол (рис. 4). Як і очікувалося, склепи з більш сильно пошкоджених timepoints часто були зламані (f; фрагмент) і склеп фракцій міститься більше фону стільникового сміття в порівнянні з тими, які пройшли без або м'який пошкодження. Під час протокол серйозно поранених кишечника бути похитнутий обережно, щоб уникнути додаткового збитку основної тканини. Потискуючи занадто грубо може привести до подальшого пошкодження склеп і більшість склепи, осідають в DR розчини, які містять ЕДТА, що призводить до додаткових порушення.
Після того, як покриття, склепи з усіх точок час ішемії вижити і здатні стати створений в культурі (рис. 5). Коли нормальний і злегка пошкоджених кишкових склепи покриті в культурі, enterospheres форму протягом 24-48 ч. З важкої ішемічного ушкодження (ч. 3 і 4) кишкові крипти вижити, але пошкоджені, що призводить до формування набагато менших сфер спочатку. За 72-120 h enteroids стають все більш складними, з очевидним Центральної люменів і багатообіцяючий структур. В цілому є скорочення зростання ефективності склепи, а також зменшення розміру enteroids, отримані з сильно пошкоджених кишечника тканини (Гонсалес, Л.М., неопубліковані дані 2017).
Малюнок 1: Хірургічні модель повного кишкових ішемії в моделі свинину. A) нормальний свинину тонкої кишки печінці. B) брижових судин були лигируют з швом, створюючи кишкової ішемією. C) ішемії, створені за допомогою бульдог судинних затискачів дозволяють для тканини реперфузії, при бажанні. D) кишечника судинну, відразу ж після видалення судинних затискачів. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 2: Гістологічних доказів (гематоксиліном і еозином (H & E) пляма) збільшення епітеліальних пошкодження після більш довший тривалості повна кишкова ішемія. Пошкодження починає на кінчику ворсинок з поступовою втрати одноклітинного епітеліального пласта, ворсинок притуплення і клітинних пошкоджень, розширення до склепу бази з важкою травмою (до 4 год. Тривалість). лінійки шкали 100 мкм. Я = ішемії. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 3: Брутто і гістологічних свідоцтва про геморагічний ішемії. A) валового фотографія порівнюючи геморагічні ішемії (ліва петля) і повний ішемії (правий петля). Коли судинну НЕ лигируют і не затиснутий рівномірно, кров може продовжувати проникати в тканини, що призводить до додаткових запалення і пошкодження. B) H & E зображення геморагічні ішемії збільшення тривалості від 1-4 ч. На додаток до клітинних ушкоджень, бачили з повним ішемії є свідчення інфільтрації червоних кров'яних клітин в межах оточуючим propria lamina. лінійки шкали 100 мкм. Я = ішемії. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 4: Аліквоти кишкових склепи, ізольованих від петлі ішемічного і нормальних кишечника. Повна, недоторканими кишкові крипти (зірочки) були успішно ізольовані від кожної петлі кишечника. Як і очікувалося, склепи з сильно пошкоджених час більше очок часто були зламані (f; фрагмент) і склеп фракцій міститься більше фону стільникового сміття в порівнянні з тими, які пройшли без або м'який пошкодження. лінійки шкали 100 мкм. Я = ішемії. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 5: Час курс зростання стовбурових клітин кишечника після ізоляції від ішемічного петлі тонкої кишки. Коли нормальні кишкові крипти були покриттям в культурі, enterospheres утворюється протягом 24-48 ч. З важкої ішемічного ушкодження (ч. 3 і 4) склепи вижити, але спочатку формі набагато менших сфер. За 72-120 h enteroids стають все більш складними, з очевидним Центральної люменів і багатообіцяючий структур. 20 мкм шкала бар, якщо не вказано. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
R-Spondin PBS 100 X 100 мкг / мл 1 мкг / мл Башка SW / 0.1% BSA 1000 X 100 мкг / мл 100 нг / мл EGF 10 мм оцтової кислоти 10000 X 500 мкг / мл 50 нг / мл A-83-01 ДМСО 1000 X 500 МКМ 500 Нм SB202190 ДМСО 3000 X 30 мм 10 МКМ Никотинамид SW 1000 X 1 M 1 мм Гастрін PBS 10000 X 100 МКМ 10 Нм Y-27632 PBS 1000 X 10 мм 10 МКМ LY2157299 ДМСО 10000 X 5 мм 0,5 МКМ CHIR99021 PBS 1000 X 2.5 мм 2.5 МКМ Wnt3a PBS 2000 X 200 мкг / мл 100 нг / мл
Таблиця 1: фактор росту реагент таблиці. Короткий опис фактора росту запасів рішень і робочі рішення, використовувані в цьому Протоколі.
