метод ПЛР

1. Суть методу ПЛР Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, PCR - polymerase chain reaction) - метод отримання...
2. Приладова база для застосування методу полімеразної ланцюгової реакції в лабораторії повинна складатися...
3. Переваги методу ПЛР
4. специфічність аналізу
5. Універсальність методу ПЛР
6. Економія часу
7. Ефективність методу ПЛР
8. Широта досліджуваного клінічного матеріалу
9. застосування ПЛР
10. клінічна медицина
11. Організація лабораторії ПЛР

Суть методу ПЛР

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, PCR - polymerase chain reaction) - метод отримання безлічі копій певних фрагментів ДНК (генів) в біологічному зразку.

Сутність ПЛР як методу молекулярної біології полягає в багаторазовому виборчому копіюванні певного гена (ділянки ДНК) за допомогою спеціальних ферментів в умовах in vitro. Важливою особливістю ПЛР є отримання копій конкретної ділянки ДНК (гена), відповідного заданим умовам. Синонімом процесу копіювання ДНК є «ампліфікація». Реплікація ДНК in vivo також може вважатися ампліфікацією. Однак на відміну від реплікації, в процесі полімеразної ланцюгової реакції амплифицируют короткі ділянки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидів).

Основні принципи

Отже, ПЛР - це багаторазове копіювання певних фрагментів ДНК in vitro в процесі повторюваних температурних циклів. Як же протікає процес реакції в межах одного температурного циклу?

Освіта нуклеотидной ланцюга здійснюється ферментом ДНК-полімеразою. Однак для початку роботи ферменту необхідна стартовий майданчик. Як майданчиків виступають "праймери" (затравки) - синтетичні олігонуклеотиди довжиною 15-20 нуклеотидів. Праймерів має бути два (прямий і зворотний), вони комплементарні ділянкам ДНК-матриці і саме фрагмент ДНК, обмежений праймерами, буде багаторазово копіюватися ДНК-полімеразою. Робота полімерази полягає в послідовному додаванні нуклеотидів, комплементарних послідовності ДНК-матриці. Тим самим в одному температурному циклі знову синтезується два нових фрагмента ДНК (тому що молекула ДНК - двуцепочечной, то і матриць спочатку дві). Таким чином, за 25-35 циклів в пробірці накопичуються мільярди копій ділянки ДНК, визначеного праймерами. Структуру окремого циклу можна представити таким чином:

1. денатурація ДНК (плавлення, розбіжність ланцюгів ДНК) - 95 ° С - 1 або 2 хвилини;
2. отжиг праймерів (затравки зв'язуються з ДНК-матрицею, температура даної стадії визначається нуклеотидним складом праймера) - 60 ° С (наприклад) - 1 хвилина;
3. елонгація ДНК (полімераза синтезує ланцюг ДНК) - 72 ° С - 1 хвилина (час залежить від довжини синтезованого фрагмента).

Приладова база для застосування методу полімеразної ланцюгової реакції в лабораторії повинна складатися з:

1. ампліфікатора (Або, як його ще називають, термоциклері);
2. системи для гель-електрофорезу з джерелом живлення (Для візуалізації результатів ПЛР);
3. системи гель-документації (Для аналізу результатів ПЛР);
4. ПЛР-боксу (Для пробопідготовки);
5. Вортекс ;
6. микроцентрифуги ;
7. набору автоматичних дозаторів (Механічних або електронних).

Крім основного і допоміжного обладнання для повноцінного функціонування ПЛР-лабораторії, необхідні деякі витратні матеріали: стерильні наконечники, пробірки, штативи для пробірок і дозаторів.

Реагентна база в звичайній ПЛР-лабораторії для проведення повноцінної полімеразної ланцюгової реакції включає в себе фермент ДНК-полімеразу з буфером, праймери (невеликі синтетичні фрагменти ДНК, комплементарні початку і кінця аналізованого ділянки ДНК-матриці), суміш нуклеотидів (А, Т, Г, Ц). Також абсолютно необхідна очищена вода.

Переваги методу ПЛР

Висока чутливість дослідження

Чутливість методу така, що ампліфікувати в ПЛР і виявити цільову послідовність можна навіть в тому випадку, якщо вона зустрічається один раз в зразку з 105 клітин.

специфічність аналізу

ПЛР дозволяє виявляти ДНК конкретного інфекційного агента в присутності ДНК інших мікроорганізмів і ДНК організму-господаря, а також проводити генотипування. Специфічно підбираючи компоненти реакції (праймери), Ви можете одночасно виявляти ДНК близькоспоріднених мікроорганізмів.

Універсальність методу ПЛР

Справа в тому, що для ПЛР-діагностики інфекційних захворювань, або спадкових захворювань людини можна використовувати один і той же обладнання, слідувати універсальним процедурам підготовки зразків (проб) і постановки аналізу, а також однотипні набори реактивів.

Економія часу

Важлива перевага ПЛР - відсутність стадій культуральной мікробіологічної роботи. Підготовка зразків, проведення реакції і аналіз результатів максимально полегшений і багато в чому автоматизований. Завдяки цьому, час отримання результату може скорочуватися до 4-5 годин.

Ефективність методу ПЛР

ПЛР допомагає уникнути відомих складнощів, що виникають при вирощуванні труднокультівіруемих, некультивованих або персистуючих форм мікроорганізмів для діагностики латентних і хронічних інфекцій. Ефективний метод ПЛР і при скринінгу збудників з високою антигенною мінливістю, а також внутрішньоклітинних паразитів.

Широта досліджуваного клінічного матеріалу

Як зразок при полімеразної ланцюгової реакції може бути використаний не тільки біологічний матеріал від хворого, але також і багато інших субстрати, в яких можуть бути ідентифіковані молекули ДНК з високою чутливістю, наприклад, вода, грунт, продукти харчування, мікроорганізми, змиви та багато іншого .

Всі перераховані вище переваги цього унікального методу - висока чутливість і специфічність, ідентифікація інфекційного агента і проведення генотипування будь-якого гена людини, висока ефективність і економія часу, універсальність приладової бази - дозволяють широко застосовувати сьогодні метод ПЛР в клінічній діагностиці, медичній практиці, наукових дослідженнях, контролі якості і багатьох інших областях.

застосування ПЛР

Області застосування полімеразної ланцюгової реакції як сучасного методу молекулярної біології різноманітні. Багато в чому це обумовлено широтою матеріалу, який можна аналізувати (практично всі, з чого можна виділити більш-менш якісно ДНК може стати об'єктом дослідження), а також підібраних праймерів. Основні області застосування ПЛР:

клінічна медицина

• діагностика інфекційних захворювань
• діагностика спадкових захворювань
• виявлення мутацій
• генотипування
• клітинні технології
• створення генетичних паспортів

екологія

• моніторинг стану навколишнього середовища
• аналіз продуктів харчування
• аналіз генетично-модифікованих організмів (ГМО)

судова медицина та криміналістика

• ідентифікація особистості
• встановлення батьківства

фармакологія

ветеринарія

наукові дослідження (молекулярна біологія, генетика)

Організація лабораторії ПЛР

Інформація для замовлення

Найменування Обсяг Виробництво Метод Кат.Номер PrecisionShuttle pTUNE Індукований Вектор OriGene PS100021 Ампліфікатор детектирующий "ДТпрайм" по ТУ 9443- 004-96301278-2010 в модифікації 5М ДНК-Технологія ПЛР в реальному часі ODTPRIME5М1 Вода без нуклеаз - R0582 Наконечники Vertex на 10 мкл, з фільтром, безбарвні, градуйовані, стерильні, 96 шт / штатив SSI SSI-4117NSFS Наконечники Vertex на 10 мкл, з фільтром, видовжені, безбарвні, градуйовані, стерильні, 96 шт / штатив SSI SSI-4137NSFS Ноутбук з передвстановленим спеціалізованим програмним забезпеченням (для ДТ-96, ДТ-322, Джин-4, Джин) ДНК-Технологія ПЛР в реальному часі I-PC / 01 Пристрій для запечатування мікропланшет "ДТпак" ДНК-Технологія ПЛР в реальному часі O-DTPACK