ЄВРАЗІЙСЬКА ПАТЕНТНА ОРГАНІЗАЦІЯ (ЕАПО)

(11) 016155 (13) B1розділи: A B C D E F G H

(21)

200900513

(22)

2007.10.02

(51)

C12N 9/02

(2006.01)
C12P 37/00 (2006.01)

(31)

(32)

2006.10.05;2007.07.25

(33)

EP

(43)

2009.08.28

(86)

PCT / EP2007 / 060460

(87)

WO 2008/040731 2008.04.10

(71)

(73) ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.(NL)

(72)

Ханс Маркус, Бовенберг Рулоф Арі Ланс, Классен Пол, Бур Ремон, Лаан Ван Дер Ян Метске (NL)

(74)

Саломатина І.С.(RU)

(54)

ОТРИМАННЯ β-лактамовое АНТИБІОТИКІВ

(57) 1. Спосіб отримання N-α-аміногідроксіфенілацетіл або N-α-амінофенілацетіл β-лактамовое антибіотика, що включає контактування трипептида гідроксіфенілгліціл-цистеїн-валін (HpgCV) або трипептида фенілгліціл-цистеїн-валін (PgCV) з IPNS для того, щоб здійснити освіту N-α-аміногідроксіфенілацетіл або N-α-амінофенілацетіл β-лактамовое антибіотика, в якому в якості вихідних з'єднань або використовують комерційно доступні трипептиди HpgCV і PgCV, або трипептиди HpgCV і PgCV отримують шляхом контактування амінокислот гідроксіфенілглі цина (Hpg) або фенілгліціна (Pg), цистеїну (С) і валіну (V) з NRPS.

2. Спосіб за п.1, в якому IPNS має ступінь ідентичності щонайменше 50% з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 1 і при вирівнюванні з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 1 містить аргінін, лізин або гістидин в положенні 185 і необов'язково модифікацію щонайменше в одному з положень 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, використовуючи нумерацію положень послідовності SEQ ID NO: 1.

3. Спосіб за п.1 або 2, в якому трипептид HpgCV або трипептид PgCV отримують за допомогою контактування амінокислот гідроксіфенілгліціна (Hpg) або фенілгліціна (Pg), цистеїну (С) і валіну (V) з нерібосомальной пептидного синтетазой (NRPS) для того, щоб здійснити освіту трипептида HpgCV або трипептида PgCV, NRPS, що містить перший модуль M1, специфічний до Hpg або Pg, другий модуль М2, специфічний до С, і третій модуль M3, специфічний до V.

4. Спосіб за допомогою одного з пп.1-3, в якому гідроксіфенілгліціл-цистеїн-валін є DLD-ρ-гідроксіфенілгліціл-цистеїн-валіном, а N-α-амінофенілацетіл β-лактамовое антибіотик є амоксициллином.

5. Спосіб за допомогою одного з пп.1-3, в якому фенілгліціл-цистеїн-валін є DLD-ρ-фенілгліціл-цистеїн-валіном, а N-α-амінофенілацетіл β-лактамовое антибіотик є ампіциліном.

6. Спосіб за допомогою одного з пп.1-5, в якому IPNS здійснює освіту пенамового β-лактамовое антибіотика, і пенамовий β-лактамовое антибіотик перетворюється потім в цефемовий β-лактамовое антибіотик.

7. Спосіб за п.6, в якому цефемовий β-лактамовое антибіотик є цефадроксилом або цефалексином.

8. Спосіб за допомогою одного з пп.1-7, який здійснюється in vivo.

9. Фермент IPNS, який має ступінь ідентичності щонайменше 50% з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 1 і яка при вирівнюванні з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 1 містить аргінін, лізин або гістидин в положенні 185 і необов'язково модифікацію, щонайменше , в положеннях 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, використовуючи нумерацію положень послідовності SEQ ID NO: 1.

10. Нерібосомальная пептидная синтетаза (NRPS), яка каталізує утворення трипептида HpgCV або трипептида PgCV, NRPS, що містить перший модуль M1, специфічний до Hpg або Pg, другий модуль М2, специфічний до С, і третій модуль М3, специфічний до V, де модуль M1 має амінокислотну послідовність з відсотком ідентичності щонайменше 50% з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 4, модуль М2 має амінокислотну послідовність з відсотком ідентичності щонайменше 50% з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 6 або SEQ ID NO: 8 і мод ль М3 має амінокислотну послідовність з відсотком ідентичності щонайменше 50% з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 10.

11. Пептидная синтетаза по п.10, в якій перший модуль M1, специфічний до Hpg, отриманий з CDA синтетази, хлороереноміцін синтетази і / або комплестатін синтетази.

12. Пептидная синтетаза по п.10, в якій перший модуль M1, специфічний до Pg, отриманий з прістінаміцін синтетази.

13. Пептидная синтетаза за допомогою одного з пп.10-12, в якій модуль М2 містить домен DCL, який з'єднаний з доменом А, що одержуються з другого модуля ACVS, в якому домен DCL є гетерологічним домену А.

14. Пептидная синтетаза за допомогою одного з пп.10-13, в якій DCL домен модуля М2 отриманий з ферменту, який є джерелом першого модуля M1.

15. Пептидная синтетаза за допомогою одного з пп.10-13, в якій DCL домен модуля М2 є доменом З сьомого модуля CDA синтетази.

16. Пептидная синтетаза за допомогою одного з пп.10-13, в якій DCL домен модуля М2 є С доменом другого модуля ітурін синтетази.

17. Пептидная синтетаза за допомогою одного з пп.10-16, в якій А і Т домени модуля М2 і повний М3 модуль отримані з ACVS, переважно бактеріальної або грибкової ACVS.

18. полінуклеотидом, що включає послідовність ДНК, що кодує IPNS по п.9.

19. полінуклеотидом, що включає послідовність ДНК, що кодує пептидную синтетазу за допомогою одного з пп.10-17.

20. Клітка для отримання N-α-аміногідроксіфенілацетіл або N-α-амінофенілацетіл β-лактамовое антибіотика, трансформована полінуклеотидом по п.18 і / або 19.

21. Клітина по п.20, додатково трансформована генами шляху біосинтезу амінокислот Hpg або Pg.

22. Клітина по п.20 або 21, що містить біосинтетичний шлях до β-лактамовое антибіотиків, переважно в якому гени, що кодують ACVS і / або IPNS, інактивовані.

23. Спосіб отримання N-α-аміногідроксіфенілацетіл або N-α-амінофенілацетіл β-лактамовое антибіотика, що включає культивування клітин за допомогою одного з пп.20-22, в умовах, що підходять для отримання β-лактамовое антибіотика.

24. Спосіб за п.23, в якому β-лактамовое антибіотик є амоксициллином, ампіциліном, цефадроксилом або цефалексином.