Використовуючи техніку селективного тиску включення, ГТО-66 в тріаді хромофора ECFP (і ГТО-57, тільки інші ГТО залишків в ECFP) можуть бути замінені 4-аміно ГТО, створюючи тим самим GdFP червоно перенесло з власний спектральних властивостей. Мас-спектрометрія повинен використовуватися для демонстрації бажаного стехиометрическим інтеграції неканонічних амінокислоти білка, з результати, показані на малюнку 1. Після цього, ми надаємо дані з мікроскопії, UV-Vis абсорбційної спектроскопії, а також стійкого стану і час і хвилі вирішені відділу Флуоресценція характеризувати властивості GdFP Флюорофор з акцентом на залежність рН спектри.
Щоб підтвердити обмін двох ГТО залишків в ECFP 4-аміно-ТРП, мас-спектрометричних аналіз проводиться. Малюнок 1 показує представник deconvoluted єси-МС спектр GdFP. У той час як здичавів тип ECFP має масу обчислюється білка 28,283.9 Так після дозрівання хромофора, відповідної маси GdFP - 28,313.9 Так. Deconvoluted єси-МС спектр GdFP експонатів основної маси пік 28,314.1 ± 0,1 Так, який відрізняється від теоретичного значення, менше 10 ppm. Перебуваючи в межах діапазону типовий точності для цього типу аналіза25, це підтверджує включення ncAA через SPI (експериментальне значення здичавів тип ECFP: 28,283.7 так).
Малюнок 2 показує конфокальний флуоресцентної мікроскопії зображень зображення (CFIM) бактеріальної клітини, висловлюючи ECFP, EGFP, EYFP і GdFP після взмучивания бактерій в PBS буфера. Всі зображення були придбані на мікроскопі оснащені УФ мета і лазерного збудження в про ту ж енергії для кожного зразка.
На малюнку 3A показує накладення зображень CFIM бактерій E. coli, висловлюючи різні FPs, включаючи GdFP, завжди спостерігає з дуже схожі енергії збудження (хвиль як показано на рис. 2). Малюнок 3B показує структуру хромофора FP варіантів показано. Що стосується яскравості GdFP, в порівнянні з ECFP (флуоресценції квантовий вихід φ = 0,4), EGFP (φ = 0,6) і EYFP (φ = 0,6) важливо відзначити, що для GdFP, придбання більш широкий спектр світла флуоресцірованія (30 Нм) був використаний на відміну від 20 Нм, використовується для всіх інших spe Сіес, для того щоб відрегулювати інтенсивність зображення або подібний. З трохи менший коефіцієнт вимирання і зниження квантовий вихід внаслідок вивчені фотофизические унікальних властивостей яскравість GdFP нижче в порівнянні з інші FPs показано.
Спектр поглинання ECFP (рис. 3 c) має дві характерні Максима на 434 Нм і 452 Нм. На відміну від GdFP характеризується одним широким червоно зміщується поглинання групи з максимум на 466 Нм. Поглинання EGFP далі червоно перенесений на 488 нм. Однак, через набагато більшою Стокс зрушення GdFP (108 Нм) в порівнянні з ECFP (41 Нм) і EGFP (20 Нм), спектр випромінювання GdFP є найбільш червоно зміщується з усіх трьох GFP похідних розслідування тут (рис. 3D). У той час як флуоресценції викидів ECFP показує дві характерні Максима на 475 Нм і 505 нм, EGFP має один широкий основних викидів група досягнувши 508 Нм (λМакс) з невеликим плеча на 540 Нм. Флуоресценції GdFP з'являється близько 565 Нм (λМакс.) (Рис. 3D). Його спектр випромінювання містить невеличкий внесок здичавів тип ECFP, яка також видно як невелику плече на 475 Нм. Ця незначна ECFP синтезується перед індукції під час процедури SPI, як опісано33.
3E малюнок показує рН залежні зміни в спектрі поглинання GdFP. Для зміни рН від 8 до 5 максимальний викид злегка зрушує червоний і незначне розширення смугу поглинання спостерігається. Однак зменшення амплітуди поглинання становить лише близько 10% між pH 8 і рН 5, вказуючи, що основного стану властивості GdFP хромофора дуже слабо зміни рН.
Час вирішити що флуоресценції викидів контролюються одиночних фотонів підрахунку показаний на малюнку 4. Розпад кривих, моніторинг в спектральних каналів, центрована 550 Нм і 600 Нм (рис. 4A) експонат трохи швидше розпаду флуоресценції в 600 Нм, в порівнянні з розпаду 550 Нм. Результати глобального fit флуоресценції розпад кривих з двох експоненційних компонентів результати в двох спектрально помітних флуоресценції розпаду компонентів з константи часу 1.0 ns і 3.3 ns (рис. 4 c і D).
Флуоресценції викидів GdFP сильно залежить від pH, як це характерно для багатьох варіантів флуоресцентного білка GFP сім'ї. Малюнок 4B порівнює флуоресценції викидів GdFP між pH 5 і рН 8, який ясно показує зниження інтенсивності флуоресценції при більш низьких значеннях рН, в той час як спектральні характеристики залишиться незмінною.
Розпаду пов'язаних спектри (DAS) 39 GdFP (рис. 4 c і D) характеризуються наявністю двох різних викидів смуг. Внесок повільно 3.3 ns компонент є більш вираженим в діапазоні коротких хвиль близько 550 Нм (60%), з незначними внесок компонента швидше (40%). На 600 Нм, обидві компоненти мають про ж амплітуди. Після переходу від рН 7 (рис. 4 c) до pH 6 (рис. 4 d), спектральні характеристики DAS навряд чи зміниться і константи часу від рутини глобальної установки також те ж саме (точність константи часу DAS йде про ± 0,15 ns ). Однак, яка очевидна різниця в абсолютних амплітуд двох компонентів Дас, повністю доводиться викидів амплітуди скорочення флуоресценції після ж зрушення pH в малюнку 4В.
Малюнок 1: представник deconvoluted єси-МС спектр GdFP. ЕСИ-МС спектр GdFP (Золотий колір, збільшене сюжет, показаний як врізні) показує основний пік на 28314.1 Так (обчислюється значення 28313.9 Так). Спектру для здичавів тип ECFP показаний в чорному. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 2: Confocal флуоресценції мікроскопії зображень від бактеріальних популяцій, висловлюючи різні FPs. Наступні параметри хвилі були використані для захоплення зображень: ECFP (λex = 457 Нм, виявлення: 461-480 Нм), EGFP (λex = 488 нм, виявлення: 495-515 нм), GDFP (λex = 476 Нм, виявлення: 560- 590 нм), EYFP (λex = 514 нм, виявлення: 520-530 нм). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 3: спектральних властивостей GdFP. (A) CFIM зображення суміші бактеріальної клітини, висловлюючи EGFP, ECFP і GdFP після взмучивания бактерій в PBS буфера. (B) хромофора структури GdFP (з 4-аміно Trp замість залишків 66), батьківських ECFP (з ГТО в позиції 66) і EFGP (з Tyr в позиції 66). (C) порівняння нормалізованих спектрів поглинання GdFP, ECFP і EGFP, тоді як в (D), нормалізованих флуоресценції емісійний спектр ECFP (збудження в 430 Нм) в порівнянні з викидів спектри флуоресценції EGFP і GdFP (обидва порушених в 450 Нм). (E) рН залежність спектрів поглинання (нормований поглинання на 280 Нм). Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 4: час вирішена флуоресценції GdFP. (A) флуоресценції розпад GdFP контроль за часом - і хвилі вирішена одиночних фотонів, підрахунок в спектральних каналів, центрована 550 Нм і 600 Нм (± 12,5 Нм) після порушення з 470 Нм лазерних імпульсів. Функцію інструментальні реакції (МАФ) містить відомості про час резолюції використовується програма установки. (B) варіації викидів спектру GdFP залежить від pH (збудження на 460 Нм). (C, D) Розпаду пов'язаних спектри (ДАС) GdFP на pH 7 (C) і рН 6 (D) визначається після деконволюции вирішена раз і хвилі флуоресценції розкладається і глобальні установки розкладається в усіх каналах глобальної набором двох експоненційних функцій з пов'язані час константи. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Малюнок 5: структури внутрімолекулярної заряду передачі ECFP (чорний) і GdFP (золото) Хромофор. Збільшення розміру хромофора системи добре електрона донором аміногрупи частиною ncAA дозволяє формування більш мезомерного структур для досягнення стабілізації резонанс збудженого стану. Точки підключення до помосту FP відображаються у вигляді півкіл. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.
Стоковий розчинконцентрація, розчинникПримітка
20% D-глюкози 200 г / Л Д-глюкози в ddH2O стерилізують фільтрацією через фільтр шприц розмір пори 0,45 мкм індолу 50 мм в ізопропіловий спирт 4-аміно індол 50 мм в 20% етанолу (20 мл етанолу в остаточний обсяг 100 мл, наповнений ddH2O) IPTG 1 M в ddH2O L-триптофан 15 мм розчиняють в ddH2O з 1 M HCl (додати HCl краплях при перемішуванні до тих пір, поки порошок є dissoved) лізоцим 50 мг / мл в ddH2O DNase I 1 мг / мл в ddH2O РНКази A 1 мг / мл в ddH2O Amp100 Ампіцилін 100 мг / мл в ddH2O Лаурилсульфат натрію (SDS) 200 г / Л в ddH2O Сульфат амонію ((NH4) 2т-4) 1 M в ddH2O Стерилізація в автоклаві калію дігідрогенфосфат (KH2PO4) 1 M в ddH2O Стерилізація в автоклаві ді калію гідрогенфосфат (K2HPO4) 1 M в ddH2O Стерилізація в автоклаві Сульфат магнію (4MgSO) 1 M в ddH2O Стерилізація в автоклаві D-глюкоза 1 M в ddH2O стерилізують фільтрацією через фільтр шприц розмір пори 0,45 мкм хлорид натрію (NaCl) 5 М в ddH2O Стерилізація в автоклаві хлорид кальцію (2CaCl) 1 г / Л стерилізують фільтрацією через фільтр шприц розмір пори 0,45 мкм заліза хлорид (2FeCl) 1 г / Л стерилізують фільтрацією через фільтр шприц розмір пори 0,45 мкм тіамі н 10 г / Л стерилізують фільтрацією через фільтр шприц розмір пори 0,45 мкм біотин 10 г / Л стерилізують фільтрацією через фільтр шприц розмір пори 0,45 мкм простежується елементи мікс Мідний купорос CuSO4, цинку хлориду (ZnCl2), марганцю хлорид (НКД2) , Молібдат амонію ((NH4) 2MoO4); кожен 1 мг / Л в ddH2O стерилізують фільтрацією через фільтр шприц розмір пори 0,45 мкм 19 амінокислот мікс 1.) розчиняють в 0,5 g L-фенілаланіну і 0,5 g L-тирозин в 100 мл ddH2O з додаванням прикопують HCl 1 M при помішуванні до повного розчинення порошку. 2.) важать, 0,5 г кожного з решти L-амінокислоти (за винятком L-триптофан). Змішати з 22 мл fo 1м х2PO4 і 48 мл 1 M K2HPO4. Додайте ddH2O близько 800 мл. Перемішайте до тих пір, поки рішення стає ясно. 3.) додати розчинені L-фенілаланіну і L-тирозин з кроку 1.) і відрегулюйте гучність до 1 Л з ddH2O. 4.) стерилізують-відпусти суміші амінокислот, вакуумної фільтрації з одиницею фільтрації верхнього пляшку. Буфери і засоби масової інформації Композиція / підготовка SDS завантаження буфера барвник, 5 x зосереджені 0,25 М трис pH 6.8, 50% v / v гліцерину, 0,25% w / v bromphenol синій, 0,5 М didhiothreitol (DTT; або ж 5% β-меркаптоетанол), 10% w / v натрію натрію (SDS) Прив'язка буфер dihydrogenphosphate натрію 50 мм (NaH2PO4), 500 мм NaCl, 10 мм імідазолу, рН 8 елюіруются буфер dihydrogenphosphate натрію 50 мм (NaH2PO4), 500 мм NaCl, 250 мм імідазолу, рН 8 діаліз буфер dihydrogenphosphate натрію 50 мм (NaH2PO4), 150 мм NaCl, гліцерин 100 мл / Л, pH 8 МС буфер 10 мм трис-HCl, рН 8 новий мінімальний носій, що містить 19 L-амінокислоти Крім L-триптофан (NMM19) Змішайте в е біржові рішення для отримання наступних остаточний концентрації: 7,5 мм (NH4) 2т4, 1,7 мм NaCl, 22 мм х2PO4, 50 мм K2HPO4, 1 мм MgSO4, 20 мм D-глюкоза, 50 мг / Л 19 амінокислот суміш, 1 мкг / Л CaCl2, 1 мкг / Л FeCl2, 10 мкг / Л тіаміну, біотин 10 мг / Л, суміш мікроелементів 0,01 мг / Л Середній LB Склад: 10 г / Л Триптон, екстракт дріжджів 5 г / Л, 10 г / Л NaCl, pH 7.0 ddH2O Підготовка: 1.) важать поза Триптон 50 g, 25 г дріжджів екстракт, 5 г NaCl в скляної пляшки 1 Л. 2.) додати ddH2O до ~ 800 мл і розчинення компонентів при помішуванні. 3.) вимірювання рН і пристосуватися до рН 7 краплях додаванням 1 М HCl або 1 M NaOH, в разі необхідності. Додати ddH2O до 1 л 4.) стерилізують-відпусти, автоклавування, потім перевірити обсяг втрат і додати стерильні ddH2O компенсувати в разі потреби. Зберігати при 4 ° C до використання. Плити агару LB Склад: 10 г / Л Триптон, екстракт дріжджів 5 г / Л, 10 г / Л NaCl, агар-агар 15 г / Л, pH 7.0 в ddH2O Підготовка: 1.) важать поза Триптон 50 g, 25 г дріжджів екстракт, 5 г NaCl, 7.5 g агар-агар в скляної пляшки 1 Л. 2.) додати ddH2O до 500 мл і розчинення компонентів при помішуванні. 3.) вимірювання рН і пристосуватися до рН 7 краплях додаванням 1 М HCl або 1 M NaOH, в разі необхідності. Додати ddH2O до 1 л 4.) стерилізують-відпусти, автоклавування, потім перевірте втрата обсягу і додати стерильні ddH2O компенсації, в разі необхідності. (Примітка: LB агар можуть зберігатися при температурі 4 ° C до використання для підготовки плити агару фунтів. Ретельно розплаву затверділих агар за допомогою мікрохвильової) 5.) коли рішення ще теплою (30-40 ° C), додати ампіцилін в кінцевій концентрації 100 мкг / мл 6.) залити близько 15 мл рідини з кроку 5.) в стерильні 10 см Петрі в стерильних умовах. Коли агар твердне, пластини можуть зберігатися для 1 тижня при температурі 4 ° C до використання. фосфат амортизоване saline (PBS) Склад: 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4, 1 мм CaCl2, MgCl 0,5 мм 2, рН 7. Стерилізація в автоклаві або фільтрації.
Таблиця 1: Stock рішення і буфера.
