ВПЛИВ КОМПЛЕКСУ Аполіпопротеїн А-I З Актіноміцини Д НА БІОСИНТЕЗ ДНК В НОРМАЛЬНИХ ТА ПУХЛИННИХ КЛІТИНАХ

1. бібліографічна посилання

1 Трифонова Н.В. 1 Князєв Р.А. 1 Поляков Л.М. 1

1 Федеральне державне бюджетна наукова установа «Науково-дослідний інститут біохімії»

Хіміотерапія є одним з основних способів корекції зростання злоякісних новоутворень. Однак цей спосіб терапії пов'язаний з ризиком інтоксикації організму протипухлинними препаратами і їх метаболітами. Тому одним з актуальних питань сучасної фармакології залишається розробка препаратів спрямованої протипухлинної дії або створення лікарських форм вибіркової дії вже відомих цитостатиків з метою посилення ефективності хіміотерапії і зниження загального токсичного ефекту на організм. У даній роботі в якості переносника протипухлинного препарату актиноміцину Д використовували аполіпопротеїн А-I. Показано, що актиноміцин Д в комплексі з Аполіпопротеїн А-I в концентрації нижче порогової знижував швидкість біосинтезу ДНК в клітинах асцитної карциноми Ерліха в порівнянні з препаратом без переносника. Отримані результати дозволяють зробити висновок про підвищення цитостатичного ефекту актиноміцину Д при використанні його в складі комплексу з Аполіпопротеїн А-I.

хіміотерапія

асцитної карцинома Ерліха

гепатоцити

актиноміцин д

транспортні форми протипухлинних препаратів

аполіпопротеїн А-I

1. Князєв Р.А., Трифонова Н.В., Поляков Л.М. Вивчення здатності ліпопротеїнів високої щільності та аполіпопротеїну А-I пов'язувати і транспортувати протипухлинні препарати в клітини асцитної карциноми Ерліха // Міжнародний журнал прикладних і фундаментальних досліджень. - 2015. - № 11-4. - С. 538-542.

2. Князєв Р.А., Трифонова Н.В., Поляков Л.М. Вивчення ефективності цитостатичної дії комплексу аполипопротеина AI з вінбластином // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2015. - № 6; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=23832.

3. Панін Л.Є., Белоногова Ж.І., Князєв Р.А., Чешенко І.О. Вплив кортизолу в комплексі з ліпопротеїнами дуже низької щільності на більш розвинутою і гепатоми НА-1 і карциноми Ерліха // Сибірський онкологічний журнал. - 2013. - № 3 (57). - С.43-46.

4. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Князєв Р.А., Панін Л.Є. Аналіз взаємодії ліпопротеїнів і стероїдних гормонів // Біомедична хімія. - 2011. - 57 (3). - С. 308-313.

5. Brace RJ, Sorrenson B., Sviridov D., McCormick SPA A gel-based method for purifi cation of apolipoprotein AI from small volumes of plasma // Journal of Lipid Research. - 2010. - V.51. - P.3370. - 3376.

6. Cho K., Wang XU, Nie S., Shin DM Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer // Clinical cancer research. - 2008. - Т. 14. - №. 5. - Р. 1310-1316.

7. Fan Y., Liu C., Huang Y., Zhang J., Cai L., Wang S., Zhang Y., Duan X., Yin Z. Dipyrithione induces cell-cycle arrest and apoptosis in four cancer cell lines in vitro and inhibits tumor growth in a mouse model // BMC Pharmacology and Toxicology. - 2013. - Р.14-54.

8. Ganta C., Chiyo D., Ayuzawa R., Rachakatla R., Pyle M., Andrews G., Weiss M., Tamura M., Troyer D. Rat Umbilical Cord Stem Cells Completely Abolish Rat Mammary Carcinomas with No Evidence of Metastasis or Recurrence 100 Days Post-Tumor Cell Inoculation // Cancer Research. - 2009. - V.69. - I.5. - P. 1815-1820.

9. Li J., Wang J., Li M., Yin L., Li XA, Zhang TG Up-regulated expression of scavenger receptor class B type 1 (SR-B1) is associated with malignant behaviors and poor prognosis of breast cancer // Pathology-Research and Practice. - 2016. - Т. 212. - № 6. - Р. 555-559.

10. Lu D., Wang Y., Li Ch., Wei G., Chen R., Dong D., Yao M. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells // Int J ClinExp Med. - 2015. - Т. 8. - №. 2. - Р. 1904-11.

11. Papeleu P., Vanhaecke T., Henkens T., Elaut G., Vinken M., Snykers S., Rogiers V. Isolation of rat hepatocytes // Cytochrome P450 Protocols. - 2006. - Р. 229-237.

12. Tzaridis T., Milde T., Pajtler KW, Bender S., Jones DT, et al. Low-dose Actinomycin-D treatment re-establishes the tumoursuppressive function of P53 in RELA-positive ependymoma // Oncotarget. - 2016.

Терапевтичний ефект препарату багато в чому залежить від здатності лікарської форми досягати патологічних ділянок. В останні роки спостерігається зростання наукових досліджень в області таргетной терапії пухлин, розроблені наночастинки, здатні виступати в якості переносників лікарських засобів [6]. Раніше нами була показана здатність аполипопротеина А-I (апоА-I) утворювати комплекси з такими протипухлинними препаратами, як актиноміцин Д і вінбластин, вивчено вплив цих комплексів на біосинтез ДНК в клітинах асцитної карциноми Ерліха [1,2]. У своїй роботі ми використовували актиноміцин Д - препаратіз групи протипухлинних антибіотиків, що продукуються Актіноміцини Streptomyces parvullus. Його протипухлинну дію обумовлено інтеркаляцією між парами азотистих основ гуанін-цитозин ДНК і перешкодою руху РНК-полімерази, порушуючи, таким чином, транскрипцію антиапоптозних генів [10]. Актиноміцин Д являє собою один з хіміотерапевтичних препаратів, які використовують в лікуванні різних видів раку, і є складовою частиною комбінованої терапії пухлин у дітей [12].

Метою цієї роботи було вивчення впливу апоА-I в комплексі з актиноміцином Д на швидкість біосинтезу ДНК в культурі клітин асцитної карциноми Ерліха та гепатоцитів.

матеріали та методи

Виділення аполипопротеина А-I

Білок отримували шляхом деліпідірованія ліпопротеїнових фракцій високої щільності (ЛПВЩ), охолодженої сумішшю етанол-ацетон (1: 1). Осад білків багаторазово відмивали охолодженим ефіром і висушували в струмі азоту. Суміш білків (20-30 мг), солюбілізірованних в розчині (2 мл), що містить 3% DS-Na (m / V), 1 мМ меркаптоетанол і наносили на колонку (1,6 х 100 см, V0 = 55 мл) з сефарозою 6В-CL ( «Pharmacia», Швеція). Елюювали 0,01 М трис-НСl буфером (рН 8,6), що містить сечовину (6 М), азид натрію (0,01%) і фенілметансульфонілфторід (1 мМ).

Швидкість потоку елюенту при хроматографії становила 10 мл / год, тривалість збору однієї фракції - 20 хв, швидкість самописця - 0,015 см / хв. Профіль елюції реєстрували на УФ-детекторі при довжині хвилі 280 нм і рівні чутливості 1,28. Перевірку чистоти апоА-I здійснювали методом диск-електрофорезу в ПААГ з DS-Na. Для поділу суміші білків використовували 3% концентрує і 12,5% розділяє гель (V / V), що містять 0,1% DS-Na. Обсяг проби становив 10-20 мкл. Електрофорез проводили в трис-гліцинового буфері (рН 8,3), що містить 0,1% DS-Na, при кімнатній температурі протягом 3 год при силі струму 10-20 мА на см2 [5]. Білкові смуги візуалізували 0,1% Кумассі G-250 в суміші метанолу та 10% оцтової кислоти (1: 1, V / V). В якості маркерів використовували набір білків-стандартів ( «Page Ruler Prestained Protein Ladder» 10-170 кДа «Thermo Scientific», США).

Знесолення апоА-I проводили методом гель-фільтрації. Розчин білка в мочевине (1,5-2 мл) наносили на колонку (0,8 х 20 см, V0 = 6 мл) з сефадексе G-25 ( «Pharmacia», Швеція), і елюювали 0,05 М калій-фосфатним буфером, рН 7,4, що містить 0,15 М NaCl. Швидкість потоку - 1 мл / хв, швидкість самописця - 0,15 см / хв.

Профіль елюції реєстрували на УФ-детекторі при довжині хвилі 280 нм. Концентрація знесоленого білка становила 0,2 мг / мл [4].

Оцінка швидкості біосинтезу ДНК в культурі клітин

Визначення швидкості біосинтезу ДНК оцінювали по включенню 3Н-тимідину. Для цього за 2 год до закінчення експерименту в клітинну культуру додавали 2мкКі / мл 3Н-тимідину ( «Amersham», Англія). Після закінчення культивування клітини ціалізуватися 0,2Н розчином NaOH. Для вимірювання радіоактивності вміст лунки (100 мкл) переносили на целюлозні фільтри ( «Whatman 3 MM», Англія), попередньо оброблені 10% трихлороцтової кислотою (ТХУ). Далі послідовно відмивали від незв'язаних мітки холодним розчином 10% трихлороцтової кислоти, потім в гарячому 5% ТХУ і сумішшю етанол-ефір (1: 1). Радіоактивність зразків вимірювали на рідинному сцинтиляційних лічильнику «Дельта-300» (TM Analytic, Нідерланди) і висловлювали в імп / хв на 1 мг білка [8]. У роботі використовували 1мМ вихідний матковий розчин актиноміцину Д ( «Applichem», Німеччина).

Виділення клітин асцитної карциноми Ерліха

Для експерименту використовували мишей-самців лінії Black, масою 20-25 г. Клітини асцитної карциноми отримували з перитонеального екссудатана 10 день після перевіванія. Асцитної рідина вносили в центрифужні пробірки і центрифугували протягом 10 хв при 150g для осадження клітинних елементів. Осад клітин тричі промивали холодним розчином Рінгера - Кребса.

Ізолювання і фракціонування клітин печінки

Процедура отримання гепатоцитів включала чотири основні етапи: (1) перфузия печінки in situ розчином Хенкса без Са ++; (2) рециркуляційна перфузия печінки in vitro розчином колагенази; (3) механічна дезагрегації тканини; (4) диференціальне центрифугування при 50g для отримання осаду очищених гепатоцитів [11]. Підрахунок клітин проводили в камері Горяєва. Життєздатність клітин оцінювали по виключенню трипанового синього [3].

Свежевиделенние клітини ресуспендіровалі в середовищі RPMI-1640 ( «Біолот», Росія), рН 7,4, що містить 20 мM HEPES ( «ICN Biomedicals, Inc», США), 2 мM L-глутаміну ( «Вектор», Росія), 100 ОД / мл пеніциліну, 50 мкг / мл гентаміцину, 5,6 мM глюкози. Планшети попередньо покривали розчином колагену (0,1 мг / мл) в 0,1% оцтової кислоти. Після сорбції колагену планшети відмивали 0,9% розчином NaCl і підсушували. Інкубацію клітин (щільність 800 клітин / мм 2) проводили в СО2-інкубаторі ( «Cole-Parmer», США) при температурі 37 ° С, вологості 85% в атмосфері, що містить СО2 (5%) і повітря (95%) [7] . Середу замінювали через 2 години після посіву клітин і утворення моношару.

Визначення зв'язує здібності аполипопротеина А-I з протипухлинним препаратом методом гасіння триптофанового флуоресценції

Комплекс апоА-I з актиноміцином Д отримували, витримуючи їх суміш в 0,05 М калій-фосфатному буфері, рН 7,4, що містить 0,15 М NaCl, протягом 15 хв при кімнатній температурі. Освіта комплексів апоА-I з актиноміцином Д підтверджували методом гасіння тріптофоновой флуоресценції. Для цього проводили титрування в термостатіруемой кюветі при температурі 20 ºС з додаванням аліквотцітостатіка (по 1мкл) до 2 мл апоА-I в ФСБ (рН 7,4). Зниження флуоресценції склало 73%. Дане зниження можна розцінювати як результат утворення комплексу аполіпопротеїн А-I-актиноміцин Д [1]. Комплекс апоА-I-актиноміцин Д додавали до культури клітин і інкубували протягом 5 ч. Актіноміцини Д застосовували в двох концентраціях: 0,1 і 1 мкг / мл [10]. В якості контролю виступали клітини, яким в середу інкубації додавали фізіологічний розчин.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми StatPlus 2009 Professional5.8.4. (США). Статистичну значимість отриманих результатів оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента при рівні значущості p <0,05.

Результати дослідження

На культурі клітин асцитної карциноми Ерліха показано, що сам апоА-I залишався вірним швидкість біосинтезу ДНК в клітинах (рис. 1). Однак присутність в середовищі інкубації одного актиноміцину Д, а також у складі комплексу апоА-I-актиноміцин Д (концентрація актиноміцину Д1мкг / мл середовища) різко знижує швидкість біосинтезу ДНК в клітинах (рис.1). Слід зазначити, що відмінності в цих двох групах між собою були незначні.

Рис.1. Швидкість біосинтезу ДНК в клітинах асцитної карциноми Ерліха. Концентрація актиноміцину Д 1 мкг / мл

* - достовірна відмінність в порівнянні з контролем (р <0,001).

Ми зменшили концентрацію цитостатика в 10 разів, таким чином вона склала 0,1 мкг / мл середовища. Виявилося, що в цій концентрації один актиноміцин Д (0,1 мкг / мл) не чинив цитотоксичного ефекту - швидкість включення 3Н-тимідину в ДНК практично не змінювалася (рис. 2). Чи не впливав на включення мітки в ДНК і апоА-I без цитостатика. Однак актиноміцин Д в складі комплексу Сапо-I знижував біосинтез ДНК в клітинах на 60% в порівнянні з контрольними величинами.

Мал. 2. Швидкість біосинтезу ДНК в клітинах асцитної карциноми Ерліха. Концентрація актиноміцину Д 0,1 мкг / мл

* - достовірна відмінність в порівнянні з контролем (р <0,04).

Слід поставити запитання: а як впливає в цій концентрації цитостатик (0,1 мкг / мл) на здорові клітини? На культурі гепатоцитів здорових щурів ми показали, що жоден з цих компонентів, в тому числі і актиноміцин Д в концентрації 0,1 мкг / мл, не чинив статистично значущого впливу на швидкість включення міченого тимідину в ДНК (рис. 3).

Мал. 3. Швидкість біосинтезу ДНК в гепатоцитах.

Концентрація актиноміцину Д 0,1 мкг / мл

висновки

Проведені дослідження свідчать про те, що комплекс апоА-I з актиноміцином Д має виражену цитостатичних дією навіть в мінімальних концентраціях у порівнянні з окремо взятим протипухлинним препаратом. Це можна пояснити наявністю на мембрані пухлинних клітин великої кількості специфічних рецепторів до апоА-I [9], що, мабуть, дозволяє препарату ефективніше потрапляти всередину клітини і проявляти протипухлинну активність.

бібліографічна посилання

Трифонова Н.В., Князєв Р.А., Поляков Л.М. ВПЛИВ КОМПЛЕКСУ Аполіпопротеїн А-I З Актіноміцини Д НА БІОСИНТЕЗ ДНК В НОРМАЛЬНИХ ТА ПУХЛИННИХ КЛІТИНАХ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2016. - № 6 .;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25713 (дата звернення: 23.06.2019).

Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»

(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)